作者gustpigex (鼻子好像灌太多了)
看板Biotech
标题[求救] DNA Gel extraction的效率很差
时间Thu Jun 9 00:26:55 2016
各位好，最近刚做gel extraction的实验，但recovery的效率非常的差，想请各位帮帮忙。
我是先用2 microgram的plasmid先用限制酶切，分离後切下来，我所要的DNA大小约13kb。
接下来是使用QIAGEN的kit做gel extraction，步骤都照着protocol做，wash的步骤加buffer後有等一阵子再离心,elute的时候又是加了水之後等一阵子才离心。我是用15 microliter的量做elution。最後用nanodrop测浓度。
做了好几次浓度都在1.5(ng/ul)，也太低了吧。
目前已排除plasmid切不完全的问题，因为不管切4hr还是切overnight浓度都差不多。
想问的问题是
(1)用kit内的elution buffer效果会不会比水好。
(2)elution buffer的体积会不会有影响。
(3)我们实验室是用QIAGEN的PB buffer做binding,但protocol是写QG buffer，虽然两者都可以拿来做binding，但不知道效果有没有差。
(4)有没有其他的小细节要注意的，或是有其他更好的kit
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1F：→ blence: 你有看过manual上那张elution体积与回收率的关系图? 06/09 00:41
2F：→ gustpigex: 有，但是同实验室的人用相同体积做，浓度就是比我高十 06/09 01:13
3F：→ gustpigex: 倍… 06/09 01:13
4F：→ xxtomnyxx: Elute 的溶液有没有先加热？用水和 TE 效果差不多，主 06/09 01:55
5F：→ xxtomnyxx: 要是差在 DNA 稳定性还有 EDTA 对後续实验有无影响 06/09 01:55
6F：→ xxtomnyxx: 我想问为什麽 protocol 写用 QG 你还要用 PB buffer? 06/09 01:56
7F：→ blence: 浓度就算高你10倍，回收率也才11%，也很惨 06/09 02:12
8F：推 as862437: 找人跟你side by side 做一次 06/09 02:37
9F：→ sy2: PB buffer只适用於液状的PCR product纯化，本身没有溶胶的成 06/09 04:53
10F：→ sy2: 分，请改用QG buffer并注意胶块大小与QG的比例，放65度C以上 06/09 04:55
11F：→ sy2: 的环境，大约每5分钟摇晃一下，看一下确保胶块溶解後再过 06/09 04:59
12F：→ sy2: column 06/09 04:59
13F：→ sy2: 液状的PCR纯化也可以用QG buffer，但因含GITC，自己配QG的话 06/09 05:06
14F：→ sy2: 成本比较高。 06/09 05:06
15F：→ gustpigex: 为什麽改用PB据说是因为更之前的学长姐在他的产品的pro 06/09 07:13
16F：→ gustpigex: tocol上把wash那一步的QG buffer划掉 写PB 之後大家都 06/09 07:13
17F：→ gustpigex: 照着做 但那份protocol不见了… 我是新来的 我就上 06/09 07:13
18F：→ gustpigex: 网看才发现是用QG 我自己也觉得很奇怪 但询问学长姐的 06/09 07:13
19F：→ gustpigex: 回答都是他们都照那份protocol做 06/09 07:13
20F：推 mswei: 我以前用这组觉得elute的体积太少elution 06/09 08:44
21F：→ mswei: 的效果也不好我自己都加到30 microliter 06/09 08:44
22F：→ mswei: 然後你的target size 13kb～这组可以抓到 06/09 08:46
23F：→ mswei: 这麽大的DNA吗？ 06/09 08:46
24F：→ gustpigex: 建议是最大抓10kb 若超过的话elution buffer要加热 06/09 09:33
25F：→ Ice9: 以前没有kit时，用的是5-10 microgram切下去，分离後以电泳 06/09 10:28
26F：→ Ice9: 在dialysis bag收集。之後再洗洗、沉淀回收。 06/09 10:29
27F：→ Ice9: 有了kit，尽量不要随意更动步骤，除非你知道差在哪里。g大的 06/09 10:32
28F：→ Ice9: 加热建议最好试一试，13kb是相对大了一些，效率问题大。 06/09 10:34
29F：→ Ice9: 建议再加大elution体积或再elute一遍。最後再蒸散些水份。 06/09 10:42
30F：推 AuroraSky: 我觉得Q牌很邪门，全世界都说赞但我遇到的三间实验室 06/09 12:19
31F：→ AuroraSky: 都用不顺，後来改用Zymo就可以上到70-80ng/ul, 06/09 12:20
32F：→ AuroraSky: 260/280 > 1.9, 260/230 > 1.9 有人有在用Zymo的可以 06/09 12:21
33F：→ AuroraSky: 分享我後来修改的protocol, 小细节注意一下产率就很好 06/09 12:22
35F：→ sy2: 的纯化binding buffer，至於你说的wash由QG改成PB是怕 06/09 15:15
36F：→ sy2: guanidine盐类残留，胶体的溶胶步骤要用含GITC或NaI的buffer 06/09 15:18
37F：→ sy2: 并且胶体纯化binding过cloumn後，在酒精wash前会用QG wash一 06/09 15:21
38F：→ sy2: 次可减少胶体残留。若没QG buffer溶胶，可以拿其他厂牌溶胶 06/09 15:22
39F：→ sy2: buffer代替，成分大同小异。 06/09 15:23
40F：→ sy2: 你的产量低，可能一开始胶没溶完全。溶胶请用QG，wash可改PB 06/09 15:26
41F：→ sy2: wash一次，再用80%酒精或kit的 Wash Buffer(要加酒精) wash。 06/09 15:36
42F：→ sy2: sorry 上头写错，改PB不是减少guanidine盐类残留，因为PB成分 06/09 16:10
43F：→ sy2: 是guanidine-HCL，而QG是guanidine thiocyanate，都有Gu盐。 06/09 16:12
44F：→ gustpigex: 谢谢大家的回应回报最新实验结果，今天我用了Q牌，gene 06/09 16:43
45F：→ gustpigex: aid(借的）和Q牌抽大sizeDNA的kit，全程照着protocol做 06/09 16:43
46F：→ gustpigex: ，elution的水有事先加热且用30ul，建议多等的步骤也有 06/09 16:43
47F：→ gustpigex: 做。 06/09 16:43
48F：→ gustpigex: Q牌的浓度为2.5(ng/ul)，G牌为12.5，Q牌抽大kit为6.5 06/09 16:43
49F：→ gustpigex: 虽然量都有提升 但Q牌还是很低，想请问各位会不会是kit 06/09 16:44
50F：→ gustpigex: 坏了……因为他们放有点年纪了。 06/09 16:44
51F：推 lail: 也有可能，曾经一起比，放很久的kit回收率真的比较差 06/09 20:59
52F：推 ad1980: 你的 plasmid 是 empty vector 吗？是的话也没有想过用 ph 06/10 02:37
53F：→ ad1980: enol/chloroform 试一下看看，我之前都是用这个做 cloning 06/10 02:37
54F：→ ad1980: (cloning)，效果不错，recovery 也高。 06/10 02:37
55F：→ ad1980: Cloning (ligation) 06/10 02:38
56F：→ ad1980: 如果要乾净一点的话就用 pcr purification 清一下，不然 06/10 02:39
57F：→ ad1980: 直接拿去做 ligation 也 ok。 06/10 02:39
58F：→ ad1980: Phenol/chloroform extraction 06/10 02:40
59F：推 ararthur: 我的经验是Gel ext kit放久蛮容易失败的 大家经验呢 06/15 02:20
60F：→ osla30: 我记得column有效期？ 06/15 19:32