作者polomi (POLOMI)
看板Biotech
标题[求救] 有关质体定序
时间Fri Jun 24 21:11:59 2016
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
若是求救事项涉及实验室智慧财产(例如细胞细菌植株、质体载体等）之分让，
请务必注明贵实验室愿意设立 正式合作或 签署材料分让协议(MTA)，否则版工将迳行删除
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有关质体的定序问题
我是用pUC18作为载体，
送入一段约1.1K的序列。
以BamHI/EcoRI作为切位，
过程中都有跑胶切胶纯化。
定序之後结果都有很多不同的点突变产生，
後来也将原本的pUC18送去定序，
利用其质体上M13F-40与M13R-48去定序。
两者中间为MCS片段，
与原本的pUC18序列比对，
发现在465位置上少了一个G，
1062位置的A变成了T。
http://imgur.com/C9iLMBN
这是否代表了我的pUC18是确定有问题的。
也造成了质体是否会影响细菌不正常生长的可能性?
而我也有做蓝白筛筛选，
在DH5a下送入pUC18 的确会产生蓝斑的。
请求各位帮助了。
迈入硕班的第三年了...
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1F：→ xxtomnyxx: 定讯萤光讯号的图呢？然後要去找到这个突变点在哪里不 06/24 21:24
2F：→ xxtomnyxx: 是很简单？那就看看有没有突变在重要的 feature 上啊！ 06/24 21:25
3F：→ xxtomnyxx: 喔好，我帮你查完了，突变点在 ori 上，这是很重要的序 06/24 21:28
4F：→ xxtomnyxx: 列，但是在我手上的资料那个序列本来就是 T 06/24 21:29
5F：→ xxtomnyxx: 我实在很想说而且也说出来了，硕班念完两年这不是基本 06/24 21:29
6F：→ xxtomnyxx: 功中的基本吗？还是说你不是分生领域的硕班？ 06/24 21:30
7F：→ polomi: 对不起，我是化学所的硕班.....我会再多加努力的 06/24 22:19
8F：→ polomi: 现在吃饭中，今天或明天会放上来定序的讯号图，可以的话， 06/24 22:22
9F：→ xxtomnyxx: 你的 pUC18 的序列是实验室的前辈给的吗？有可能是前辈 06/24 22:28
10F：→ xxtomnyxx: 给的序列有错喔。建议你上网搜寻 pUC18 的 序列来比对 06/24 22:28
11F：→ xxtomnyxx: 看看。 06/24 22:28
12F：→ xxtomnyxx: 另外，你如果是用一般的 Taq polymerase 把 DNA 放大再 06/24 22:29
13F：→ xxtomnyxx: 切酵素跑胶纯化然後接到 pUC18 的话，1.1K 是有可能有 06/24 22:30
14F：→ xxtomnyxx: 突变，通常要做 cloning 的时候用的 polymerase 会是比 06/24 22:31
15F：→ xxtomnyxx: 较高级的 High-fidelity polymerase 06/24 22:31
16F：→ e104582001: 有时候定序不要只是看序列，有问题的地方要看该位置讯 06/24 22:34
17F：→ e104582001: 号的 pick 的单一度，有时候可能是误读 06/24 22:34
18F：→ blence: 猜,不是真的有突变,而是1.1k太长,讯号不佳软体误判pick 06/25 00:33
19F：推 Invec: 加油 06/25 00:46
20F：→ blence: 至於那2个点突变,其实把addgene跟NCBI的pUC18来blast就会 06/25 00:48
21F：→ blence: 觉得pUC18的序列应该不只一个版本 06/25 00:49