作者pongpongding (胖胖丁仔)
看板Biotech
标题[求救]PCR一直跑不出来
时间Mon Jul 4 16:43:17 2016
大家好，实验室同伴跑PCR一直跑不出来，这实验曾经一度有做出来过，只是後来不知怎
麽地就一直失败，持续失败了半年，也爬过很多文，就是找不出方法。实验室的学长、助
理(我)都跳进来帮忙做过，因为大家都是这方面的新手，所以一开始一直以为是操作问题
，所以用相同的条件重复了n次，primer、polymerase也都重买过，还是出不来。後来因
为有了positive control，positive control 都有跑出来，但想要的 gene 就是跑不出
来，而且都有拖带，希望大家能给一点改善的意见，谢谢！
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我们有 blast 确定设计的 primer 专一性没问题，也可以夹出要的 gene。
F primer 的长度是36, GC%=44 Tm=64.4
R primer 的长度是37, GC%=54 Tm=68.9
gene大小是 2.8 kb
postive control是 2 kb
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下面是几张在有postive control後，跑胶的结果
一开始用的是下面的条件：
PCR program：
1. 95’c, 30sec
45~55’c, 30sec
72’c, 2mins (35 cycles)
2. 72’c, 8mins
3. 16’c, hold
genomic DNA template ： 50 ng
dNTP：500 μM
F&R primer：0.5 μM
10x buffer：2 μL
sterile DI water：13 μL
Pro Taq Plus DNA Polymerase：2 units
*total reaction： 20 μL
http://imgur.com/psXkP16
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爬了一些关於有拖带的文章，看到了几个可能原因：
1.template浓度太高
2.dNTP浓度太高
3.primer浓度太高
4.cycle数太多
5.annealing温度太低
以及有些版友推荐在 reaction 加 1~5% 的 DMSO
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所以做了一些改变
PCR program：
1. 95’c, 30sec
2. 95’c, 30sec
50~65’c, 30sec
72’c, 2mins 30sec (30 cycles)
3. 72’c, 8mins
4. 10’c, hold
genomic DNA template ： 50 ng
dNTP：200 μM
F&R primer：0.2 μM
10x buffer：5 μL
sterile DI water：40 μL
Pro Taq Plus DNA Polymerase：2 units
*total reaction： 50 μL
http://imgur.com/ywo2Swu
结果还是一样拖带....Orz
想请问大家还有其他改善方法吗？
是应该在增加DMSO浓度？还是说还是太多cycle吗？
版上有看到有些人建议加 Betaine，但因为看到这种解决多是增对 GC rich 的片段，加
上我们实验室没有，请问有需要添购吗？
拜托大家帮帮忙了!!!!非常感谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.120.93.70
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1467621799.A.2F7.html
1F：→ storm780121: 曾经一样p不出来，gDNA再稀释10到100x 产物就出现了07/04 17:21
看来稀释两三倍太秀气了，再来试试，谢谢！
稀释成 5ng/50μL 结果连postive control 都没出来了囧
2F：推 jabari: Pro Taq应该是波士特自家的? 你买个管R牌或B牌的HF试试?07/04 17:24
3F：→ jabari: 或者Promega的GoTaq 有时候换Taq跑得出来07/04 17:25
4F：→ pongpongding: 我们是有用过t牌的 max hot start 也没跑出来耶，用07/04 17:54
5F：→ pongpongding: 不推现在的taq是吗？为什麽 postive contorl出的来07/04 17:54
6F：→ pongpongding: ，target gene却出不来呢？不同基因还是会适合不同07/04 17:54
7F：→ pongpongding: 的polymerase吗？(新手有点菜sorry07/04 17:55
8F：推 jabari: 不是不推 ProTaq我以前在120.99用得很开心 问题是有些基因07/04 18:01
9F：→ jabari: 跟霍青桐一样 "那都是很好很好的Taq，可是我偏不喜欢"07/04 18:01
10F：→ pongpongding: 了解！再来试试看，谢谢07/04 18:06
※ 编辑: pongpongding (111.83.149.104), 07/04/2016 18:10:57
※ 编辑: pongpongding (111.83.149.104), 07/04/2016 18:17:50
11F：→ osla30: DMSO 2,4,6,8,10%都试试07/04 18:50
好!!
结果今天试了，都没成功，10%的在<200bp的地方竟然还出现一条band，不知为何><
12F：→ osla30: ampliqon 2x master mix red这个很神，可以用这个试试07/04 18:52
目前没预算，希望用现有的资源试试看，如果还是不行再试试，谢谢提供新资源喔！
13F：→ milkpa: DMSO+107/04 22:13
14F：推 micocat: 夹gene是要表现的吗？建议用proofreading的enzyme
07/05 01:07
是之後要做突变的
15F：→ micocat: template是gDNA的话denature可以更高 96~98℃07/05 01:08
好谢谢！
16F：→ Ice9: 2.8kb 是包含 intron?07/05 06:19
是欸
17F：→ Ice9: intron内的诡异序列很多。一般建议分段取得再合起来。07/05 06:21
一开始其实是用cDNA做，一直失败才改用quality比较稳定的gDNA，如果改回用cDNA会比
较好吗？
18F：→ Ice9: 然後，positive control的template也是gDNA吗？07/05 06:25
是，是同一个 template dDNA，谢谢唷
※ 编辑: pongpongding (114.38.149.138), 07/05/2016 07:49:58
19F：→ blence: 要不要用gDNA或cDNA不是取决於你要不要intron吗？ 07/05 10:07
20F：→ blence: 为什麽会说因为quality的考量,来决定用gDNA或cDNA?07/05 10:08
21F：→ blence: 至於你回答micocat说夹基因是要做突变,所以不用要表现吗？07/05 10:11
其实是因为实验室同伴的RNA一直抽不好，造成cDNA的quality也备受质疑，所以改用确定
quality比较好的gDNA先确定实验p不出来是不是primer的问题
※ 编辑: pongpongding (140.120.93.70), 07/05/2016 10:23:01
22F：→ blence: 如果改用gDNA是为了测试primer好不好,那现在data已经显示 07/05 10:28
23F：→ blence: 不ok,照你们的预期,不就可以认定primer,然後别再试条件了 07/05 10:30
24F：→ blence: 又或者,既然觉得换primer也没解决问题,也就是问题还未知 07/05 10:31
25F：→ blence: 与其花在gDNA上troubleshooting,应该放心力在cDNA多尝试吧07/05 10:32
恩恩！想想也是，之前想的太草率了，一心只想赶快找出方法p出来，谢谢你耐心回覆～
26F：→ a90648: 要测primer能不能用建议在同condition下测07/05 11:31
27F：→ a90648: intron上常有一堆诡异序列P不出来不一定是primer问题07/05 11:32
恩恩，我会再从cDNA试试，谢谢。
28F：→ Ice9: 我的建议和B大基本一样。另外，实验室有没有别人已抽好的， 07/05 11:37
29F：→ Ice9: 品质基本令人满意的cDNA，拿那个当template吧。07/05 11:39
30F：→ Ice9: 然後用gDNA去夹，最好先排除有没有pseudogene或多基因问题。 07/05 11:41
请问一下用blast可以确认pseudogene的问题吗？谢谢～
31F：→ Ice9: 呃，上述的然後是语气上的然後，不是指事件。07/05 11:43
32F：推 jabari: 是说 预算这好解决...跟业代要个5rnx的酵素 来试 应该都会 07/05 13:58
33F：→ jabari: 给07/05 13:58
原来如此，立马来找业务，谢谢！
※ 编辑: pongpongding (140.120.93.70), 07/05/2016 14:48:46
※ 编辑: pongpongding (140.120.93.70), 07/05/2016 15:01:10
34F：推 osla30: ampliqon原厂可找万旺，另外我怀疑有帮OEM的有两个 07/05 15:58
35F：→ osla30: 创世纪的Q-Amp 2x ScreeningFire与图尔思的SuperRed 07/05 16:01
36F：推 jabari: BTW..有时候P不到 就往外面再设引子看看 说不定是indel07/05 20:00
37F：推 carolian: 基因序列也会影响，之前我的实验有个基因约2.5kb，AT比07/06 15:11
38F：→ carolian: 例大概65%，PCR extension温度用72℃ P不出来，後来找pa 07/06 15:11
39F：→ carolian: per看，extension温度改用60℃~65℃，annealing时间延 07/06 15:11
40F：→ carolian: 长一些1.15 min/1kb就成功了，一样用protaq，可以参考 07/06 15:11
41F：→ carolian: 看看 07/06 15:11
42F：→ raiyu: 5 6年前赶毕业时也一直p不出来，狠下心用master mix就p出来 07/06 21:18
43F：→ raiyu: 了 好像是跟慧众买的 (当时因为管帐的学长该该 所以我直接 07/06 21:19
44F：→ raiyu: 自掏腰包买 记得价钱还不至於太肉痛) 07/06 21:19
45F：→ raiyu: 不过後来也没有认真找到底是哪里出了问题 就是个学长用原本07/06 21:22
46F：→ raiyu: 的Taq就p得出来，我就p不出来 卡到阴的状况 07/06 21:23
47F：→ jabari: 自掏腰包这也太恐怖了-.- 07/06 23:44
48F：→ osla30: master mix都不会太贵，几百元吧，尤其量大的话可压更低 07/07 00:07
49F：推 jabari: 我的意思是 怎麽样也不该学生自掏腰包-.-07/07 03:53
50F：→ osla30: 话说学生时期我也掏过腰包买支喂食针测试实验XD 07/07 07:56
51F：→ raiyu: 因为博班学长该该叫 反正我重点是"毕业" 懒得花心力去争 07/07 09:25
52F：→ raiyu: 不过毕业後 没用完的我也没留下来XD 07/07 09:26
53F：推 qazbamboo: 前面几个cycle 设计更低的温度看看，我之前这样就成功07/08 20:39
54F：→ qazbamboo: 了07/08 20:39
这几天忙着赶计画的实验还没重新去抽RNA，感谢上面几位的建议，我会再好好试试
看～
※ 编辑: pongpongding (111.83.204.77), 07/09/2016 06:49:07
※ 编辑: pongpongding (111.83.204.77), 07/09/2016 06:49:32
55F：推 Alstonia: gene还蛮长的，建议检查templeteDNA 的quality, 可以的 07/12 00:02
56F：→ Alstonia: 话用好点的kit抽，别用那种含有机溶剂，最後酒精沉淀收 07/12 00:02
57F：→ Alstonia: 尾的。 07/12 00:02