作者a14743535 (pig)
看板Biotech
标题[求救] transfection 细胞变少
时间Fri Aug 12 15:19:14 2016
大家好
我最近在用Panc1这株细胞做转染的实验
转染试剂是用lipofectamine 2000 (2uL/well)(24well的条件)
DNA总量为3.5ug/well
细胞取80000颗种入24孔盘
在20-24小时的时候开始转染
在加入了Lipofectamine/plasmid complex 培养4-6小时之後
更换成新鲜培养基
这个时候我在吸除含转染试剂的培养基时候
就发现 常常会有细胞被我吸起来而变少的情况
有时会有很明显的一大片消失(之前其它细胞HepG2, CHO-K1也是)
我记得lipo本身就是有毒性的
所以细胞或多或少变脆弱被吸走也是正常
问了我的同事们有没有也会这样
他们说还好 没有很明显
於是我想知道到底我这情况是不是正常
或是能做什麽改善？
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 203.71.94.19
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1470986356.A.57F.html
1F：→ blence: 我觉得lipo2000在24well用2ul是非常多(毒)的,有调整空间 08/12 15:37
我是照着它在24well的最低建议量来试的
不知道blence大 建议可以下修到多少？
2F：→ darkdoor: 现在毒性小很多的试剂价钱也不差.不用一定坚持lipo2000 08/12 16:31
3F：→ saviora: 用3000这些升级版的 应该可以减少毒性 08/12 18:07
没办法~实验室还剩很多lipo2000
※ 编辑: a14743535 (36.226.246.166), 08/12/2016 22:09:47
4F：→ lail: 细胞太满吗？所以整片被吸起来了 08/12 22:27
5F：推 tynse71864: 咦新版跟旧版差好多… 我24well才下0.8ug DNA+2ul lip 08/12 22:36
2uL lipo2000 大大不是跟我用的一样吗？
但我DNA总量为3.5ug/well
6F：→ tynse71864: o ; 但通常我 lipo会砍半或再砍半(即2.5)用 08/12 22:36
是0.5手误成2.5吗？
7F：→ tynse71864: 前一天细胞养在哪里啊 08/12 22:36
就直接种在24well里，培养20~24小时；开始进行转染
※ 编辑: a14743535 (36.226.246.166), 08/12/2016 23:10:44
8F：推 gustpigex: 实验室剩很多没办法买3000的话 2000的可以促销给我们> 08/13 00:34
9F：→ gustpigex: < 08/13 00:34
10F：→ blence: 在24well要用到3.5ug,那lipo用2ul也不够阿 08/13 00:36
11F：→ blence: 要先降低DNA用量,如果已知是plasmid或RNAi效率问题 08/13 00:38
12F：→ blence: 应该跟本去换backbone,而不是忍受超多的DNA用量 08/13 00:40
13F：→ lail: 我之前6-well一个well送4 ug DNA,LF2000 加10ul 08/13 10:06
14F：推 tynse71864: 是0.5ul sorry; 新版的 DNA建议量都有点太高,找一下旧 08/13 12:21
15F：→ tynse71864: 版的 08/13 12:21
16F：→ genep: DNA 太多, lipo用2, DNA用1差不多. 08/14 00:24
前几天老师要我把plasmid都直接拿去跑电泳~
确认一下是不是都还是处於非linear的样子
如果不是linear 那是不是single band
到这里我就有个问题
plasmid 不是有circular form及supercoiled form
难道这两者不会同时出现吗？
然後我看我的电泳图
看起来plasmid都有一些变成linear form但量不多
这是我抽plasmid的技术不好吗？
※ 编辑: a14743535 (203.71.94.31), 08/15/2016 13:34:50
17F：推 ABULA666: 如果你的plasmid是直接抽完作transfection，当然理论上 08/19 02:09
18F：→ ABULA666: plasmid是circular，又会因机率出现supercoiled form 08/19 02:10
19F：→ ABULA666: 所以你在胶上当然不会看到linear，除非你有用限制酶切 08/19 02:12
20F：→ ABULA666: 另外想看linear和circular最好用TAE bfr.，不知是否用这 08/19 02:13
21F：→ ABULA666: 回归回来，如果所有的试剂,培养液和细胞都跟别人一样 08/19 02:14
22F：→ ABULA666: 但实验做出来你的就是有问题，那就请人看你操作是否没问 08/19 02:15
23F：→ ABULA666: 题，反之如果材料不一样，可能有污染之虞，请更换再试 08/19 02:15
24F：→ huosheng: 消失整片的状况，我有遇过，只是主要在换optiDMEM过程 10/16 09:36
25F：→ huosheng: 中观察到，实际原因还不太明确，可以尝试medium沿壁面缓 10/16 09:36
26F：→ huosheng: 慢加入 10/16 09:36