作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
标题[求救] plasmid用insert primer P出vector??
时间Wed Aug 17 21:15:25 2016
前情提要：
我用的vector是thermo的pJET1.2，大小2974 bp
insert大小约4.2 kb，是用HiFI系列polymerase出来的blunt end产物，切胶纯化
按protocol ligate後使用自制的competent转型，amp筛
隔天长出约100个colonies
挑8个colonies抽mini，做RE digestion
没切出预期的片段，只有Vector，没有insert，或insert大小不对
但因为不信邪...
拿抽好的plasmid，用insert的primers跑PCR跑胶
结果八个都有跑出Band！！但都是vector的大小 (3000左右)！！
不太明白为什麽会这样...
是污染的意思吗？
抱歉是Cloning新手，有爬文也和其他人讨论过
之後会用别梯的PCR产物repeat实验
但在这之前很想知道这次的结果代表哪个环节出了问题
谢谢！！
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※ 编辑: kaofei (118.165.158.16), 08/17/2016 21:16:36
1F：→ blence: 你会不会觉得那个3000,刚好是你加入的vector template？ 08/17 21:21
2F：→ kaofei: 我是这麽觉得的，但我不太懂为什麽会这样... 08/17 21:41
3F：→ kaofei: 因为我是用insert的primer去P的@@，怎麽会P出vector 08/17 21:42
4F：→ kaofei: 还是说我其实也没P出东西，是我vector浓到直接跑胶就有ban 08/17 21:43
5F：推 Bows: 其实这大小不用太多就会有band 了，用一管没有p的跑看看 08/17 22:12
6F：→ Ianthegood: ligation有很多虫可以抓 交代一下vector/insert如何 08/18 01:31
7F：→ Ianthegood: 处理 浓度 ligation condition呗 08/18 01:32
8F：→ kaofei: ligation是按protocol，22度C一小时，V:I=1:5 08/18 19:16
9F：→ kaofei: 然後我今天用没P的plasmid跑胶，果然出现3000bp的band... 08/18 19:18
10F：→ blence: 算一下照protocol是不可能V:I有1:5的,肯定有算错或误解 08/18 19:29
11F：→ blence: 而且这套我用起来几乎不会有vector only,肯定pJET是过多 08/18 19:31
12F：→ kaofei: 这次ligation是一个很熟pJET的朋友带我做的，protocol上 08/18 19:36
13F：→ kaofei: 写可以按比例调整ratio，不太懂为什麽不可能1:5？因为我朋 08/18 22:02
14F：→ kaofei: 友都是用1:5去ligate的@@"，当天加的量也请他确认过。 08/18 22:04
15F：→ Ianthegood: vector有cip过吗? primer 5'有phosphate吗? 08/18 22:14
16F：→ Ianthegood: 1:5 量勒? 08/18 22:15
17F：→ blence: pJET1.2用blunt-end cloning kit,不需cip或加P啦 08/18 22:19
18F：→ blence: protocol算一下,20ul reaction中取50ng pJET,依照1:5计算 08/18 22:19
19F：→ blence: 你的4.2k需要350g,占全部20ul中的8ul,固浓度至少43.8ng/ul 08/18 22:19
20F：→ blence: 如果是切胶纯化用20ul水来elute,代表PCR产物几近0.9ug 08/18 22:20
21F：→ blence: 如果先不管切胶纯化效率了,如果PCR若不混合5~10管如何办到 08/18 22:20
22F：→ blence: 又如果这kit需要混合多管,显示PCR效率不佳,也无法达如此量 08/18 22:23
23F：→ blence: 最可能的解释是用错1:5的意义,造成vector加太多,导致最後 08/18 22:25
24F：→ blence: colony长出一大堆不该长的false postive 08/18 22:27
25F：推 ABULA666: 我之前用过这个kit，建议:(1)vector only太多请用kit附 08/19 01:58
26F：→ ABULA666: 的水(2)insert和vector的比例可多试几种(3)ligation时间 08/19 01:59
27F：→ ABULA666: 可以再长(如o/n)，反应温度可用14或4度尝试(4)确认你的 08/19 02:00
28F：→ ABULA666: 片段可在你用的competent cell和temp.及抗生素浓度下 08/19 02:01
29F：→ ABULA666: cloning到 08/19 02:01
30F：→ ABULA666: 与其在这里看半天考虑用哪个的建议不如多试几种cloning 08/19 02:03
31F：→ kaofei: 谢谢大家的建议，但我不太懂B大的问题，如果我PCR产物有经 08/19 11:52
32F：→ kaofei: 过DCC，浓度不就能提高吗？我测picodrop浓度是77ng/ul，故 08/19 11:53
33F：→ kaofei: 当时加的量约5，这样应该有到350ng不是吗@@还是我误会了.. 08/19 11:55
34F：→ kaofei: 然後想在请问B大说的false positive是指空的vector污染在 08/19 11:57
35F：→ kaofei: plate上还是只competent cell吞进空的Vector长出来，我以 08/19 11:59
36F：→ kaofei: 吞空Vector不会长的...因为自接会induce lethal gene 08/19 12:00
37F：→ kaofei: 还是这个机制并不可靠?? 08/19 12:01
38F：推 ABULA666: 我认为会导致false positive跟水乾不乾净有关，kit附的 08/19 14:14
39F：→ ABULA666: 水通常比较乾净，如果是不乾净的水容易混nucleotides， 08/19 14:15
40F：→ ABULA666: 有机率卡在vector blunt-end，所以跑胶时就会看到跟 08/19 14:17
41F：→ ABULA666: vector类似大小的片段 08/19 14:17
42F：推 ABULA666: b大说的是指加太多DNA到competent cell里，DNA的体积应 08/19 14:20
43F：→ ABULA666: 小於competent cell的10%，太多会影响转形效率 08/19 14:21
44F：推 ABULA666: 至於这机制是否可靠，就我经验若水够乾净挑到vector 08/19 14:24
45F：→ ABULA666: only的机率不会太高 (约占10~20%)，如果是用从自来水做 08/19 14:26
46F：→ ABULA666: 的sterile ddH2O机率会变很高 08/19 14:26
47F：→ blence: 抱歉,楼上误解我的说,我认为是加太多pJET,但insert不够多 08/19 14:28
48F：→ blence: 导致太多pJET跟杂质(nt)接在一起,甚至两两自黏 08/19 14:28
49F：→ blence: 如果要讲浓度就用Qubit测,不然就用切胶前的band去评估量 08/19 14:28
50F：→ blence: 因为一般状况我不相信这样的PCR会做出>500ng的纯的产物 08/19 14:29
51F：→ blence: 至於水,我们都是ddH2O灭菌後开来用的,通常用的V减少,我都 08/19 14:31
52F：→ blence: 直接送seq不跑胶的,用这kit只需要检查seq有没有突变就好 08/19 14:32
53F：→ Ice9: 抽好的 Plasmid，为什麽要 PCR 再跑胶？直接跑胶确认size不 08/20 23:36
54F：→ Ice9: 不更快更省。顶多花半小时到一小时加RE切一切。 08/20 23:37
55F：→ kaofei: I大说的对，是我没想通见笑了XD" 08/21 17:29