大家好 本板首Po，如有触犯板规还是甚麽的请尽速通知谢谢 最近做Western老是有时候做得出来有时候又做不出来(明明是同一个sample) 做pull down的Western明明没问题，跑细胞protein的Western却老是出问题 困扰我很久所以想请问大家是不是我哪里有出问题 原本跑出来是这样http://imgur.com/nxJszRV 或这样http://imgur.com/aY92h4A Myogenin和FLAG算是有符合预期 但定量不怎麽对所以又跑了好几次 但最近老是跑成像这样http://imgur.com/tEqoZxd 想请问大家我是不是有哪里出问题 流程列在下面了，想请大家帮我看一下，谢谢！ --------流程开始------- 收cell protein是用1x DPBS wash两次後 加入RIPA buffer (含0.1% SDS, 1x protease inhibitor, 1x phosphotase inhibitor)後 用1000 μl的tip刮破细胞後收lysate，4℃ 全速离心半小时後取上清液 测OD595算浓度後取50 μg(用二次水或RIPA buffer补到每个sample体积一样)和4x sample buffer混合 92~95℃煮5分钟後用100 V跑SDS-PAGE Transfer是使用半乾式transfer 我Transfer前先让PVDF membrane浸泡在methanol至少1分钟、 厚片滤纸及gel浸泡在1x transfer buffer 先将滤纸放上正极板上，再依序放PVDF membrane、gel、滤纸叠上并挤掉气泡 (多的transfer buffer用割stacking gel的那个绿色塑胶片涂平在正极板上) 用10 V, 200 mA跑1.5小时 (因为要transfer 2片gel所以用200 mA) 跑完後依marker将预期位置的PVDF割下来放入塑胶盒， 用5 % BSA (以1x TBST配置)进行blocking，室温1小时 1小时後blocking倒掉先加5 % BSA，再加入一抗，4℃ o/n 隔天再拿出来室温1小时 (学长说有的抗体还需要这步骤让其binding更好还是啥的) 用1x TBST wash 3次，每次10分钟 倒掉1x TBST後先加入1x TBST，再加二抗，室温1小时 再用1x TBST wash 3~4次，每次10分钟 PVDF放擦手纸上使其稍微乾一点後用配好的ECL反覆淋5次以上 放擦手纸上使其稍微乾一点後放到底片夹的透明膜里去暗房压片 -------流程结束------- 其实我个人猜想是不是transfer出问题，但问学长他不认为是transfer的问题 关於transfer另一位学长说只需要定电流即可(一片gel用90 mA for 2 hrs，两片则电流加倍以此类推)，他说因为电压会随buffer加的量而有所不同 我只定电流几乎做不出像上面第一张图或第二张图那样 (但pull down我只定电流都没问题，有观察到只定电流电压会升到10~15 V) 带我做实验的学长却连电压一起定，每次我都有观察到电压一到10 V後电流就开始往下掉，但他说电压有到就好了，有时候这样就做得出来 我看网路上教学影片还有看到把正极板上的buffer吸乾而不是像我们这样涂平的，然後他是定电压 想请问半乾式transfer到底哪个做法才对？ blocking用BSA或脱脂奶粉好像也没影响 另外想请问抗体是否也可能影响结果？ 像我问学长FLAG是否可用mouse monoclonal的FLAG一抗，他都叫我用rabbit polyclonal的FLAG一抗 虽然我觉得做不出来大概还是我技术的原因居多...... ------------------------- 附上buffer成分 10x running buffer:30.3 g Tris base, 144 g Glycine, 10 g SDS,用二次水配成1L 1x running buffer就是将10x的用二次水10倍稀释 10x transfer buffer:30.3 g Tris base, 144 g Glycine,用二次水配成1L 1x transfer buffer就是取50 ml 10x，加二次水到450 ml後再加50 ml methanol再混匀，平常存4℃ 10x TBST:40 g NaCl, 12.1g Tris base, 5 ml Tween20,用二次水配成500 ml, pH 7.6 1x TBST就是将10x的用二次水10倍稀释 4x sample buffer:10 ml的 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), 1.6 g SDS, 8 ml 100% Glycerol, 80 mg Bromophenol blue, 1.6 ml β-me 平常存在-20，分装1 ml，要用时将那1 ml放室温等它融後再使用 -------------------------- ps.做胶参照类似这张表http://imgur.com/IMtaj8x 做8 % gel跑FLAG，10 %跑Myogenin 如提供资讯不足请再通知 谢谢！ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 111.248.103.200 ※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1472399550.A.C43.html loading和抗体我每次都下一样的量喔 顺便想请问如果loading减半那transfer条件要改吗？ 谢谢！ ※ 编辑: MLSHBen (140.112.122.57), 08/29/2016 11:07:15 想请问sigma那支难用的意思？因为我也有用成功过一次...那为什麽Rab会比较好用？ 图的话我用电脑都看得到，用App我反而是第二张看不到（如果有需要的话我等一下改一下） 谢谢！ ※ 编辑: MLSHBen (140.112.121.239), 08/29/2016 15:05:16 ※ 编辑: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 18:16:44 ※ 编辑: MLSHBen (140.112.122.57), 08/29/2016 18:20:24 图有重弄一下可以帮我看一下这次看得到吗？ pull down那个就是IP，不过现在跑的这个lysate一开始跑就像第三张图那样 是後来学长和我照我上面写的流程重跑一次才得到第一张图的结果 然後之後自己再做一两次有得到第二张图和第三张图的结果 ※ 编辑: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 18:45:25 ※ 编辑: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 18:48:45 前面tynse71864大提到只能定电压或电流其中一个，另一个是最高上限 那照我的流程就是一开始电流定在200 mA，当电压到最高上限10 V时就变成定电压的意思吗？ 所以问题可能会是在这边吗？ 谢谢！ ※ 编辑: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 20:24:17 ※ 编辑: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 20:25:04 ※ 编辑: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 20:28:51 请问怎麽看marker来知道有没有出事？是指marker的band变有一点点圆和厚吗？ 如果是这样那该怎麽解决呢？ 谢谢！ 话说最近压片明明没压多久(大概不到1分钟吧)也会把marker给压出来 所以也有想说会不会是blocking的问题导致第三张图那样？ ※ 编辑: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 20:54:55 sample是上个月月初收的，保存在-80 反覆解冻大概五次左右 听说实验室学长的sample好像反覆解冻好几次都还可以跑的样子 难道跟RIPA buffer里加的protease inhibitor有关？ 先谢谢大家这麽热情地帮我解惑！ 由衷感谢！ ※ 编辑: MLSHBen (36.229.234.9), 08/30/2016 02:53:33