作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
标题[求救] 用Oligo dT跟一Forward primer取代3' RACE
时间Sun Sep 4 17:17:11 2016
大大们好：
想请问有人有用过oligo dT跟Sequence里的forward primer去跑PCR
夹出用oligo dT转出的cDNA(RNA有poly A tail)吗
会这麽做是有点想避开3' RACE，而且实验室有人有成功过(虽然是不同的RNA)
不知道有没有经验可以分享一下
我之前做常会遇到well很亮，但没有band的情形
用了hot start
步骤大概是：
PCR mixture (GeneDirex HiFi系列) without polymerase 95度C 4 min後迅速放回冰上
再把polymerase加进去，然後on一般的program (initial denature, denature...)
结果well卡章的情形有好转，目标band也慢慢出来了，只是亮度都很淡而且有杂band
所以就提高了annealing temperature(55-->60)，杂band有减少，但目标band还是不亮
因为实验需要定序RNA的全长，这个片段需要被Clone出来
希望PCR product的量能多一点
不知道有没有人有甚麽方法可以帮忙改善这个情形
或类似经验可以分享的，谢谢！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.112.96.149
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※ 编辑: kaofei (140.112.96.149), 09/04/2016 17:17:54
1F：推 jabari: RACE就多屁股的Anchor而已...多跑一圈乾净很多 09/04 23:09
2F：→ jabari: 况且你都用Hifi在跑了 多跑一次跑嘛跑嘛 09/04 23:11
3F：推 Ianthegood: 推楼上XD 09/05 00:09
4F：→ Ianthegood: 或是多换几种polymerase跑啊 有时候便宜的才跑得出来 09/05 00:11
5F：→ kaofei: 了解，所以不用担心多跑一次序列可能出错吗?或者HiFi超威? 09/05 00:18
6F：→ kaofei: 还是因为我要先切胶纯化的关系@@"，这样是不是会比较保险 09/05 00:18
7F：→ Ianthegood: 只要你的error rate<10^-4 第一次做错的在第二轮会被 09/05 00:47
8F：→ Ianthegood: 稀释到不见 就切正确的size多挑几个clone定序罗 09/05 00:48
9F：→ xxtomnyxx: 我想问问你为什麽会想避开 3' RACE ? 09/05 00:50
10F：→ kaofei: 主要是如果这样做得出来，就不用再多买个kit，单纯经济些 09/06 09:03
11F：→ kaofei: 没甚麽太厉害的理由其实XD" 09/06 09:04
12F：→ xxtomnyxx: 咦？不是只要多订一条带有 adapter 的 dT primer 吗？ 09/06 10:58
13F：推 jabari: 3'race不用kit...上网找manual, 定primer 就好 09/06 13:58
14F：→ kaofei: XD" 了解，抱歉学艺不精，会再努力的，谢谢！ 09/06 15:31
15F：→ Ice9: 目标产物有多长？会不会有 isoforms? 09/06 18:44
16F：→ kaofei: 大概1600 bp，isoform是指@@"...抱歉这部分还没很了解orz 09/06 21:24
17F：→ xxtomnyxx: 你去 NCBI 找你的目标基因(记得选对物种)点进去看， 09/06 22:02
18F：→ xxtomnyxx: Genomic regions, transcripts, and products 栏位如果 09/06 22:02
19F：→ xxtomnyxx: 你的基因有超过一条线，就是有 RNA isoform 09/06 22:02