作者aaaazzzz (找英文家教)
看板Biotech
标题[求救] 请问大家多用哪一家polymerase?
时间Fri Sep 30 18:05:36 2016
想请问大家在construct基因的时候，
通常是用哪一家的牌子可以得到非常低的错误率?
最近在做一个约3K的基因，
要将其塞入pCMV-2A的质体，
花了快三周的时间确定整段序列正确(已经将整个CDS分四段定序完成)，
下一步做了八种不一样的点突变，
原本只定序突变的位置，
(因为一次定序约800-1000bp，保守是600bp)
有同仁建议还是整段定序比较好(整段定序就要多花三倍的钱)
结果定序结果出来八个序列有三个出现各一到二个胺基酸(胺基酸真的改变)错误，
学理上可能不影响我的实验结果，
但为了科学的真实性，
我还是又花了一周多的时间重作，
结果错误的三段里面，
其中有二段基因还是错误，
而且错的地方跟我第一次错的地方不一样，
因为定序是委托基龙..做的，
有爬过文，
看大家对他们的家的primers不大满意，
所以我想是不是定序出现错误，
就在附近设计另一段倒回来的primer，
结果定序跟前一次相同(表示定序应该是OK的，讯号非常明确)
我使用的polymerase是NEB的Q5 DNA Polymerase，
业务跟我说是市场上最佳精确度，
比别家正确率高很多，
另外Pfu错误率为1/130,0000，
以我约3kb的大小，
错误率低於1/400，
但我这系列重组约14段(单一或数个点突变)，
其中有五段有问题，
出错的机率也太高了！
不晓得各位版友，
大多使用哪家的Pfu来construct，
谢谢！
附注：我使用60度，30cycles，其他比例依照原厂(NEB)提供
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1F：→ Bows: 你有看基米的定序图吗，有时候是他从pick转文字会有错 09/30 18:12
2F：→ Bows: 我基米的定序有错会再去对pick 09/30 18:12
3F：→ aaaazzzz: 有看,波型很明确(没有杂band,也不是很多的A or T or C 09/30 18:19
4F：→ aaaazzzz: or G叠在一起,而且错的地方离primer约3-400bp，所以也不 09/30 18:20
5F：→ aaaazzzz: 是因为定序的尾巴或头造成的错误(指讯号不稳定) 09/30 18:20
6F：→ blence: 除非seq比较怪,我觉得不应该会有突变,另外错误率1/400不是 09/30 19:10
7F：→ blence: 这样算的 09/30 19:15
8F：→ aaaazzzz: 回b大，我一开始也以为我原本突变的点成功就好了(那附近 09/30 21:34
9F：→ aaaazzzz: 的序列也正确)但没想到多订头尾之後,出现不同位置的错误 09/30 21:34
10F：→ aaaazzzz: 有一次还由TCA出现TAA(stop codon，那当然要重做)的突变 09/30 21:38
11F：→ aaaazzzz: 还有一般观念说Taq错误率高，但没想到我用了具有Pfu功能 09/30 21:40
12F：→ aaaazzzz: 的polymerase，错误率也高得离谱，正准备向别家购买 09/30 21:40
13F：→ blence: 你如果用site-direct方式做,30cycle也太多了 09/30 22:33
14F：→ aaaazzzz: 没错，我是用site-directed mutagenesis，一开始先设计 10/01 00:38
15F：→ aaaazzzz: 两段部分互补的序列(包含我想要突变的部分),P了30cycles 10/01 00:39
16F：→ aaaazzzz: 之後,两段使用1:1当成模板,再用头尾的primers,再P 30 10/01 00:40
17F：→ aaaazzzz: cycles，所以b大建议我调低cycles数？但先前用25 cycles 10/01 00:41
18F：→ aaaazzzz: 来P，看起来band很微弱 10/01 00:42
21F：→ blence: 多了10cycle就1000倍了,你的长度又达3k,很难不会有突变 10/01 00:50
22F：→ blence: 去增加template,或参考先前文章调整reaction或primer 10/01 00:56
23F：→ xxtomnyxx: 就我所知，Q5是当今排名第二，第一是Platinum SuperFi 10/01 02:04
24F：→ xxtomnyxx: ，Phusion排第三，不过SuperFi和Phusion都能 1kb/15s， 10/01 02:05
25F：→ xxtomnyxx: 而且还有dsDNA binding能让Tm提高，所以我比较推这两个 10/01 02:06
26F：→ xxtomnyxx: 然後我如果做template是plasmid的PCR，我都加已纯化的 10/01 02:07
27F：→ xxtomnyxx: plasmid 500 ng/ 100 uL PCR reagent然後跑25 cycles， 10/01 02:08
28F：→ xxtomnyxx: primer也都下最高浓度F和R各 1 uM。 10/01 02:09
29F：推 hitmd: 可与该区业务联系，请公司帮你抓问题点 10/04 12:13
30F：→ aaaazzzz: 感谢b大与x大回覆，我再试试看25cycles效果如何 10/18 18:47