大家好，又来问问题了...这次是跟转RT去除genomic DNA污染有关 就是我想要amplify 一段 (+) ssRNA病毒的sequence 方法是用Qiamp viral RNA kit抽cell lysate的viral genome 然後用Roche的first-stranded cDNA synthesis kit转RT 之後用paper发表的序列(不是配对好的F跟R，因为我想要夹的片段较大)跑PCR 我的目标产物约5400 bp，这对primers是可以夹出来，但是量都很少(35 cycles) 而且在1600的地方会有超亮(大概Target band 10x以上)的杂band，well也很亮 试过调整Ta後没甚麽效果，想说genomic DNA污染是个问题，把它去掉再跑看看 但因为手边没有DNase，我想到实验室还有另一个quantitech for qPCR的转RT kit 里面有个东西叫gDNA wipe out buffer...也许可以拿来用用 我就姑且一试 按protocol 12的RNA(对...我没测浓度没有稀释)加2的gDNA wipe out 42度2分钟後置於冰上 然後我就直接转到Roche的protocol Briefly就是 11的RNA(刚刚的mixture)加2的sequence-specific primer 65度C，10分钟後置於冰上 然後加入7的RT的mixture 先室温10分钟，然後50度1小时，最後85度5分钟去活化，放冰上 接着跑PCR 结果1600的Band完全没了，但我的target band也没了... 剩well很亮然後smear下来 所以我想请问 1. gDNA wipe out buffer里应该是有DNase吧 2. 我的结果有可能是因为DNase把我的cDNA或RNA或Primer乱水解所造成的吗 我查资料说DNase去活可以用加热或是EDTA 可是我并没有在开始合成我的cDNA或跑PCR以前做任意两者之一来去活DNase (Quantitech的protocol中也没有特意加热去活的步骤， 但我不确定是否之後的buffer有特别的Formula可以完成这件事) 但好像PCR一开始Denaturer 90几度可以发回同样的功能阿... 所以我比较担心还是在合成cDNA这部分。 不知道有没有人有经验可以分享，当然如果不行我就会重新找专一性更高的primer来try了 谢谢！ --

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