作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
标题[求救] 小鼠肠道组织研磨
时间Thu Oct 13 22:59:58 2016
版友们晚安
最近要将小鼠的小肠上皮细胞 (IEC) 做均质化
之後要上超高速离心 分出ER与Golgi
然而最近卡在细胞无法打破的窘境
几乎8~9成的protein都在unbroken pellet中
因此来求救
均质方法:
IEC先以swelling bfr [10mM HEPES +1xPI (protease inh)] 5min
再加入2x的homogenize buffer (10mM HEPES, 150mM sucrose, 0.5mM DTT, 1x PI)
此处我试过用Tight Dounce homogenizer 30次或是30G 针头 30次
磨碎後离心 分出pellet 与sup
再取相同比例做western blot
(以Calnexin做ER marker/GM130为golgi marker)
大部分蛋白都在pellet中 并没有被打破
[有以Huh7 cell line 当作技术练习
一样的方法下 大部分的蛋白都会跑去sup 留在pellet的很少]
希望有类似实验的版友们能提供些建议了 谢谢!
PS: 有找过paper 会使用nitrogen cavitation bomb来破细胞
但周遭的实验室都没有这个仪器... 想请问有人使用过吗?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 36.228.136.225
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1F：→ sunorange: 可以先用液态氮磨过再抽 10/14 20:47
怕LN会把我要看的胞器都爆开了...
※ 编辑: tynse71864 (36.228.136.225), 10/14/2016 22:36:00
2F：→ signo: 举手.要不要试着将胀破细胞的时间延长?另,离心转速不行太高 10/23 01:49
3F：推 hypocrisyha: 不好意思请问楼上转速大概要多少呢？(刚好也遇到同 10/24 21:09
4F：→ hypocrisyha: 样问题QQ 10/24 21:09
5F：→ signo: 用过500g来分未破的细胞+核,但分的目标不同,buffer也不同.. 10/25 00:31
6F：→ tynse71864: 我以为这篇没人回了@@ 我猜那个10k*rpm是要快速把细 11/05 01:50
7F：→ tynse71864: 胞离下来 (怕低速时间太久会破太严重 11/05 01:50
8F：→ tynse71864: 我後来试过10-15分钟 (看起来)没问题 15之後我的 gr 11/05 01:51
9F：→ tynse71864: adient分层会开始模糊 11/05 01:51