小弟我不算分生新手 该知道的基本操作步骤都知道 硕士期间开始接触plasmid construct 刚开始做初期成功率也有60% 後来当了三年多助理 construct plasmid成了一个很基本的技术 挑的clone成功率90%以上很正常 几乎没有重做三次内做不出来的construct 我这一年多来换工作後 construct非常不顺利 连TA cloning成功率也很低 常见的状况是 transform隔天single colony很多 常常破百 可是 用restriction enzyme切 大小总是不符预期 重做5次 挑了50个colony 90%的pattern都一样 切出来pattern可以再现 但都不对 ex: 我预期切出来是3.1 kb + 1.0 kb 可是切出来90%都是3.5 kb + 0.6 kb 甚至发生总大小比预期大的状况 ex: 预期plasmid最後是7.3 kb 却看到7.0 kb + 1.5 kb 定序结果都不对 或者enzyme切出来不对 colony PCR结果 90%的clone band却正确 可是定序一样不对 因为我不是新手 硕士毕业 又有三年多实验室助理经验 这种基本实验却一直失败 过去一年来construct成功率只有一成左右 可是我同事们都很顺利 很少发生重做三次内没成功的状况 让我压力很大 我跟主管 同事请教过 试过很多方法 https://www.neb.com/tools-and-resources/troubleshooting-guides/troubleshooting-guide-for-cloning 这类troubleshooting的资料也看不少 譬如ligation 加PEG3350 (final concentration 7.5%) 用commercial competent cell, RecA1 (抑制DNA recombination) http://download.rbcbioscience.com/HIT%20Competent%20Cells/Competent%20Cells/HIT-21/HIT-DM.pdf 我是用HIT-DH5alpha 一年过去了 还是没什麽改善 进度缓慢 压力很大 归纳常见状况 1. 转型顺利 single colony很多 常破百 但enzyme切出来结果不对 2. 我用只有insert上才有 vector没有的切位 enzyme可以切出band 推测insert有接进去 但大小不对 想请教各位是否可以给我什麽建议 提醒我其他该注意的细节 谢谢 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 203.70.89.22 ※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1478174756.A.B75.html