作者treelove (Jörg)
看板Biotech
标题[求救] western blot 侦测不到大量表现的蛋白
时间Fri Nov 4 23:15:45 2016
大家好 想请问下
我用35S-promoter 大量表现一个transcription factor, 在Arabidopsis上建立
transgentic lines,在RNA上用RT-PCR 和q-PCR测是有
比wild type大量表现 (从10-50倍都有), 问题出在要用western blot 测protein
level时, 一直做不出来 (有放positive control有成功所以操作技术没问题 ),
目前猜测是量太少,想请问除了用Immunoprecipitation外还有没有其他方法去侦测?
又,有没有甚麽方法可以证明这些protein是没有功能的
(因为phenotype几乎没有, 我怀疑这些protein没被制造出或是可能没功能)
可以给个关键字让小弟有点头绪吗?
(因为急着要在2个礼拜内赶出来)
谢谢各位~
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1F：→ e104582001: 是什麽 protein 很重要，盲猜很难，也不知道你WB是否 11/05 00:01
2F：→ e104582001: 步骤有问题 11/05 00:01
3F：→ e104582001: 某些蛋白质只能用固定的步骤去跑 11/05 00:01
是transcription factor
[1;37m推
tynse71864: 是什麽蛋白 (？) 有可能你送的细胞就是无法协助此蛋 11/05 00:35
4F：→ tynse71864: 白的产生 试试看外送到一般会表现此蛋白的细胞？ 11/05 00:35
5F：→ tynse71864: 我之前也做过 cell line怎麽外送就是没结果 老鼠直接 11/05 00:36
6F：→ tynse71864: 收一大团的蛋白 11/05 00:36
7F：→ tynse71864: 如果是我说的情形 找找看是否制造此蛋白需要别的蛋白 11/05 00:37
8F：→ tynse71864: 帮忙 ；同时外送也可以解决 11/05 00:37
9F：→ tynse71864: 至於“没有功能”这句怪怪的 既然都没有表达了 何来 11/05 00:39
10F：→ tynse71864: 功能之有 11/05 00:39
就...在猜为甚麽detect不到的原因, 会不会是protein level出问题XD
11F：→ lail: 用什麽系统表现？收蛋白质的时候确定有收到该蛋白质？有RNA 11/05 07:30
12F：→ lail: 不代表有蛋白质，看功能就做functional asssy，然後就看该蛋 11/05 07:30
13F：→ lail: 白质有什麽功能就去测试吧 11/05 07:30
是transgentic line, 萃取植株中的protein, 有在PVDF上用染protein的显色剂去确认
有protein存在PVDF上
※ 编辑: treelove (140.112.248.180), 11/05/2016 08:44:41
※ 编辑: treelove (140.112.248.180), 11/05/2016 08:45:41
※ 编辑: treelove (140.112.248.180), 11/05/2016 08:48:06
14F：推 lucifer74: 用更好的抗体、ECL、机器，换tag 11/05 08:57
15F：推 lucifer74: 改用inducible promoter、35S的多筛一些independent li 11/05 08:59
16F：→ lucifer74: ne 11/05 08:59
17F：→ lucifer74: 用大量组织，浓缩核蛋白再跑WB 11/05 09:01
18F：推 tynse71864: tx factor应该在核内？ 收蛋白的条件应该可破？ 11/05 23:30