作者LinNereus (Nereus)
看板Biotech
标题[求救] 用TRIzol LS Reagent 萃取DNA 品质低落
时间Sun Dec 4 23:41:52 2016
各位前辈麻烦指导一下小弟我，
小弟我是化学系而非生科相关科系，
但因为实验上需要所以有在萃取DNA，
我们样品都是全血经由kit组萃取，
但後来因老板的方向，希望在同一样品萃取出RNA和DNA，
所以选用TRIzol LS Reagent作为萃取试剂。
萃取DNA的步骤是：
(前面TRIzol LS Reagent 用 4mL)
1. 之前萃取完RNA後的tube里面含有中间层及有机层还有残余水层去做离心。
2. 离心後去除水相。(会稍微吸掉一些有机层，但也不太确定有没有完全去除水层。)
3. 加入2mL 100% EtOH (用手上下反覆摇晃均匀，静置3min。)
4. 离心 2000g, 7min, 4度。
5. 倒掉上层液体，留下沉淀。(这边沉淀一大坨，很像槟榔渣。)
6. 加入5.5mL的 0.1M sodium citrate in 10% ethanol并震荡使沉淀脱离tube底部。
7. 室温静置30min，後离心 2000g, 5min, 4度。
8. 移除液体，留下沉淀。
9. 6~9步骤重复三次。
10. 加入9mL 75% EtOH，摇晃震荡後静置室温,20min。
11. 离心 2000g, 5min, 4度，後移去液体留下沉淀。
12. 10~11步骤重复三次。(此时很像槟榔渣的沉淀仍然在。)
13. 真空抽乾5~10min。
14. 加入400 uL 8mM NaOH 回溶。
15. 离心 1200g, 10min, 4度。
16. 把含DNA的液体吸出转移到新tube。(有用0.22um小飞碟过滤，因为大沉淀还在。)
把液体拿去测吸收算浓度，得到结果如下：
http://imgur.com/a/nbZSG
小弟不知道为什麽浓度会如此之高，然後品质如此低落...
实验室没有学长姐用TRIzol做过萃取RNA或DNA，
一开始怀疑是否是有机溶剂或盐类残留，所以75% EtOH那边洗了3次，
但是结果还是一样，整个大崩溃Q-Q...
想请教有经验的前辈给个指导，
或者是告知我我步骤哪里错误。
谢谢各位。
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1F：→ Ice9: DNA 不够纯啊。步骤5和6之间，可以多一点phenol-chloroform 12/05 20:42
2F：→ Ice9: 的步骤。另外，样本不够分成两半，一半用TRIzol抽RNA，一半 12/05 20:43
3F：→ Ice9: 用其他方法抽 DNA 吗？ 12/05 20:43
4F：→ sunorange: 同时抽RNA和DNA本来效果就不太好 。最好的就是楼上的 12/05 23:23
5F：→ sunorange: 做法 12/05 23:23
6F：→ Ianthegood: trizol抽dna效果本来就很糟 12/06 17:54
7F：推 tynse71864: 顺带一提 抽蛋白也不太好 12/07 23:19
8F：→ lesswind: trizol抽dna效果本来就很糟+1 12/08 21:12
9F：推 ko363630: Trizol不是主要用於RNA isolation吗？而且你的步骤也少 12/27 16:49
10F：→ ko363630: 了CHCl3与IPA沈淀 12/27 16:49