作者virusgg (kiwivivi)
看板Biotech
标题[求救] WB压片很糊
时间Sat Dec 10 02:33:01 2016
请问大家
这周我做WB的时候跑SDS都很顺利，Maker都很清楚。
可是tranfer完後小分子maker就糊掉了。
压片後70kDa以上也都糊了，但是actin却还可以，请问这是那个环节出问题?
http://i.imgur.com/C93sjZY.jpg
http://i.imgur.com/hyp3pLl.jpg
跑的条件
12%gel
65v 15min 115v 到10kDa到底
pvdf膜先泡甲醇活化
黑色) 一片海绵一片吸水纸 胶 膜 吸水纸 海绵
转的是400mA 80分钟
800ml tranfer buffer+200ml methanol
拜托各位大大了!!!!
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1F：→ blence: 附图没marker看不懂 12/10 09:33
2F：→ blence: 每个size都有最适合的gel%,如果%过低,actin也是会糊掉的 12/10 09:37
上图是actin 43的
下图是parp 89/116
3F：推 tynse71864: 咦你只有一片吸水纸？ 不是两片吗 12/10 13:06
我这次只放一片，比较薄，之前用原场的比较厚所以都用一片。
4F：推 lail: 70kd可以跑10%，比较美 12/10 15:14
谢谢^^本来要同时压17的 所以用12% 是否有点太贪心XD
5F：推 tz2733: 看不太懂问题 是指小分子跟70kDa以上都糊 只有actin(42左 12/10 22:42
没错没错，就是这样。
6F：→ tz2733: 右)是正常的 这样吗? 12/10 22:42
7F：推 iyorain: 给你参考~60v跑1hr 100v跑2.5hr 注意保冷 小分子跑比较久 12/11 01:07
8F：→ iyorain: 过热胶会溶掉 transfer 180ma 80分钟 12/11 01:07
感谢! 跑胶的条件试试看，可是有个小疑问180ma ??
※ 编辑: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:37:41
※ 编辑: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:38:43
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※ 编辑: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:41:42
※ 编辑: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:42:59
9F：→ blence: 如果会过热溶胶请检查一下buffer,因为比原po更长的条件我 12/11 09:37
10F：→ blence: 们都在用,另外"小分子跑比较久",这应该是写错了 12/11 09:43
11F：推 tz2733: 作胶时下胶底部有时会有很小气泡 仔细看才看得出来胶有点 12/11 11:09
12F：→ tz2733: 波浪状 所以跑到太底部的话小分子蛋白就会歪七扭八的 然 12/11 11:09
13F：→ tz2733: 後12%同时看你要的大中小分子是ok的 猜测是否transfer时 12/11 11:09
14F：→ tz2733: 胶融了? actin 看起来ok只是因为它量多......只是猜测 12/11 11:09
15F：→ tz2733: 给你参考 12/11 11:09
16F：推 tynse71864: 12%胶应该没问题 我可以从17压到120 12/11 15:51
17F：推 htLiu: 可能是Transfer时温度太高 12/13 12:21
18F：推 biotip: 看起来可能是1抗体专一性问题2定量未准确3蛋白质可能表现 12/13 16:14
20F：推 iyorain: transfer时我不会调那麽高~会低於180mA 12/13 20:15
21F：→ virusgg: 发现温度偏高就会开始糊，在跑SDSPAGE的时候，就发现make 12/14 12:09
22F：→ virusgg: r糊了，60v 20min 110v 95min。 12/14 12:09
24F：→ virusgg: 大家若遇到压出来，有的很乾净有的很脏，明明操作都同时 12/14 12:26
25F：→ virusgg: ，且脏的还没有要的band会先 12/14 12:26
26F：→ virusgg: 1.一抗比例调高 12/14 12:26
27F：→ virusgg: 2.wash时间加长为一小时，10分钟换一次 12/14 12:26
28F：→ virusgg: 3.换抗体 12/14 12:26
29F：→ virusgg: 4.先去大吃一顿再说...== 12/14 12:26
30F：推 tz2733: 跑胶就温度太高 请确认你的running buffer及胶配方 有没 12/14 18:19
31F：→ tz2733: 有错 这电压条件跑胶应该ok 12/14 18:19
32F：→ virusgg: running buffer是买的，不会错吧== 12/14 19:11
33F：推 tz2733: 稀释倍数错误也是有可能发生的呀~~ 12/14 20:16
34F：→ roy047: 同意楼上, 10倍稀释有时变成9倍, 11倍稀释之类QQ 12/15 03:07
35F：→ blence: 自行google会看到running buffer真的有两种,主要差异在 12/15 11:38
36F：→ blence: glycine,分别是192mM与250mM 12/15 11:38
37F：→ virusgg: 谢谢大家，那天要稀释20x running buffer时特别观察一下 12/21 23:38
38F：→ virusgg: ，竟然发现放在下层4℃冰箱中的buffer 结冰了== ，结了 12/21 23:38
39F：→ virusgg: 一层冰，看建议储存是4℃~25℃，我还放蛮底下的冰箱门边 12/21 23:38
40F：→ virusgg: 。所以果然是稀释倍率问题。 12/21 23:38