作者cowmama311 (牛妈妈)
看板Biotech
标题[求救] mtt细胞存活率
时间Thu Jan 12 19:39:42 2017
各位大家好，我的实验是利用牛耳朵细胞来做实验，是利用荷兰牛跟黄牛的耳朵，做热处理再利用mtt来测存活率。
实验的步骤是，细胞解冻後24小时就继代，待细胞养到八九成满後，接种到96well分别做两种浓度 一个是十的五次方 一个是十的六次方
每孔加100ul，分三组
分别为控制组、热处理12h、热处理24h。
热处理培养箱温度为42.5 7%co2
同一时间接种完後先放38.5度 5%co2培养
培养24小时後先将热处理24h移入热处理培养箱
36小时候後将12h热处理组移入热处理培养箱
而控制组则是一直都在38.5度培养箱中。
热处理完後倒掉培养液
三组於同一时间加mtt药剂（1mg/L）每孔加50ul，放回38.5培养箱3小时，再取出倒掉mtt 药剂在加入50ulDMSO摇晃10分钟，在去测od值
可是测出来的存活率都是热处理比控制组存活率来得高，问了老师老师只说是我们自己的问题，因为方法是学姐教我们的，我们也做了五六次了，数据出来都是这样，也请学姐从头到尾看一次我们实验，也没找出什麽问题，可是数据就一直都不能用…………恳请各位大大们帮帮我吧…
一直失败感觉超级失落。。。。
-----
Sent from JPTT on my Samsung SM-P355Y.
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 180.177.177.42
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1484221185.A.3CE.html
1F：→ raiyu: 那你用显微镜看实验组细胞也比较多吗? 01/12 19:55
2F：→ raiyu: 实验组的温度会不会影响粒线体的活性? 所以影响MTT结果 01/12 20:15
今天看过了 处理组跟控制组细胞看起来一样多 哭
3F：→ Bows: 用手(计数器)算算看，若结果相同就是你们老师该去处理的事了 01/12 21:37
4F：→ Bows: 不是所有实验都会如预想的结果一样 01/12 21:37
5F：→ Bows: 若老师执意觉得是学生问题，那就块陶阿 01/12 21:37
你说接种在96well里头做完处理後再把细胞打起来算细胞数？
6F：→ Bows: 除非有之前人有做过预期的结果 01/12 21:38
之前学长用tunel跑flow有跑出有差异 可是现在我们用mtt测就一直做不出来....
7F：推 tynse71864: 同 B大，後面学生推翻以前实验室的结果不算不常见，尤 01/13 08:54
8F：→ tynse71864: 其当先前条件不 detail时 01/13 08:54
9F：推 tynse71864: 想问一下，有做 blank组吗 (完全没细胞的) 01/13 09:53
没有耶 都是sample直接测
10F：推 satantaco: MTT因为跟粒线体有关 所以会有假阳性的可能 要排除 01/13 10:55
11F：→ satantaco: 必要时可能还是要计算数量来比对 或者再做LDH来互相比 01/13 10:55
再试这最後一次 希望老师会死心
大大还有推什麽比较简单可以测存活率的方式吗？
12F：→ satantaco: 照 才会精准 01/13 10:56
13F：→ raiyu: 测细胞存活率还有其他的实验方法 01/13 13:50
有努力想让老师换别种方式
14F：→ cowmama311: 感谢各位 目前老师还是想尝试 他有更改一些试验方式 01/13 16:54
15F：→ cowmama311: 增加三个控制组 分别为接种完24 36 48小时测 就 01/13 16:54
16F：→ cowmama311: 让他弄最後一次吧 有跟别的老师讨论过 外系老师想 01/13 16:54
17F：→ cowmama311: 法跟大家一样 认为换个方法去测比比较好 但是我老师 01/13 16:54
18F：→ cowmama311: 执意要我再测一次 只好陪他试这最後一次吧 01/13 16:54
※ 编辑: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:55:45
※ 编辑: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:56:56
※ 编辑: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:58:59
※ 编辑: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:59:24
※ 编辑: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:59:54
※ 编辑: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 17:01:05
19F：→ blence: 细胞刚解冻,MT活性还没回来,测MTT可能没变化 01/13 18:16
20F：→ blence: per 96well可以放十万,百万颗? 牛耳朵细胞非常小颗吗 01/13 18:16
21F：→ blence: 细胞多,final MTT浓度却比常用的少几百倍,以前都这样做? 01/13 18:17
22F：→ blence: DMSO 50ul在96well在shaker应该摇不均匀,是用reader振的? 01/13 18:17
方法是学姐教的 这也是我一第一次做
因为学姐用猪耳朵细胞做有最出来
所以老师要我们也试试
关於要种的细胞数量 在下一次实验我会试试种10000颗的看看
震荡的话使用这个
http://i.imgur.com/7L01yNI.jpg
23F：→ blence: 加MTT前是不是该让各组细胞都回到同温,反应效率才一致? 01/13 18:17
24F：→ raiyu: 另外 感觉你的细胞种得有点多+1 96well一般癌细胞我最多种 01/13 18:51
25F：→ raiyu: 1万颗/well 做24hr 有时候细胞太多 生存条件不佳也有可能造 01/13 18:53
26F：→ raiyu: 成细胞死掉 01/13 18:53
27F：→ raiyu: (对实验设计小小建议) 2组的温度差其实不大 培养箱温度并不 01/13 18:57
28F：→ raiyu: 是这麽准喔 01/13 18:57
29F：推 darrenyo: 最多10000 +1 01/13 23:23
30F：推 cyuchien: 总共要养3天。会不会像楼楼上说的，控制组细胞太多有些 01/14 19:19
31F：→ cyuchien: 爆掉了。 01/14 19:19
32F：推 aaa111bb2: 怎麽不做positive control? 01/15 17:42
？？？？
33F：→ e104582001: 96 well 1000000颗 太多了啦，20000~100000基本上多 01/15 18:42
34F：→ e104582001: 树细胞都会太满了 01/15 18:42
※ 编辑: cowmama311 (118.233.44.232), 01/15/2017 23:25:16
※ 编辑: cowmama311 (118.233.44.232), 01/15/2017 23:26:37