※ 引述《huangsw (Orz)》之铭言： : 43 : : 谢谢大大的建议 : : 因为是重复先前的实验，所以会一直参考前人的做法 : : 我发现之前的学姊似乎没有比较induction前後的差异，但是因为实验室之前有纯化过其他蛋白，所以大家都不怀疑这样的induction条件，只担心inclusion body是否产生，但是学姊之前的测试结果是没有inclusion body，也能够纯化出蛋白 : : 如果说induction条件真的不好，我有甚麽地方能改进呢，毕竟IPTG浓度已经用到1mM了，感觉只能增加表达时间? 然後因为没有inclusion body所以并不需要改变温度? : : 不过说到底老师还是一直认为是清洗的步骤不好QQ~但我已经没招了 : 前人种树後人乘凉, 但是难免有种歪的时候, 导致後人被压伤, 这在科科界时有所闻. : 另外, 操作的手法也有可能会造成差异. : https://goo.gl/zMzalH : 请看上面这张图, 理想的induction(中文应该是诱导?), : 应该要可以达到这张图Lane 1 2的样子(未纯化). : induction本身牵扯到细菌的生长与复制, 意味着可以改的地方也有很多. : 不仅仅是IPTG和OD=0.5~0.6这两个条件而已, 其实温度也可以改. : 但是在做这些事情之前, 我觉得还是要先确认一下这个菌株仍有大量表达的潜力. : 如果没有, 又想把事情做好的话. 那就砍掉重练. : 先把现在BL21的plasmid抽出来, 定序一下, 确保nucleotide是正确的. : (如果你找的到DH5alpha的菌株也行, 通常都用这个保存plasmid) : 然後重新tranform(转形)到DH5alpha与BL21 并且妥善保存. : BL21的部分, 从transform的涂盘中, 挑选数个候选人(candidate)进行表现量的测试. : 挑到产量好的, 再去做induction的测试 (搞不好这时候就不用做条件的修改了). : 先确认有大量表现, 版友才好继续帮你抓药. : 如果有不懂的地方, 多看看paper也许会看到有用的资讯. : Good luck. 谢谢大大们的建议，我已经开始进行有无induction的比较 我的认知是如果要增加表现量就是增加induction时间,IPTG浓度,表现温度 其他条件的改变(譬如低温长时间表现)只是要避免inclusion body的产生 不知道这个想法是不是错的 plasmid的序列之前已经定过所以没问题 然後BL-21挑表现较好的菌这步骤学姊做过，我目前是拿他挑的菌来用(约一年多前，都冰-80) 取菌方式是用tip沾一点丢入LB，保存的菌瞬间冰回去 还是其实菌并不能保存这麽久? 不过不管怎样如果测试结果真的是无法大量表现 小弟会听从建议打掉重练 --

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