※ 引述《s992003 (Lord of Ethanol)》之铭言： : 不常发文，排版差见谅 : 小弟最近在重复学姊的实验，用His-tag纯化蛋白 : 但是不管怎样都不纯，蛋白量也不多 : 实验条件是先以含有表达序列的pET28a 载体放入BL-21菌株中 : 接着涂盘筛选挑菌放入含有50ug/mL的LB broth中培养16小时 : 接着各加5mL的菌液到两瓶500mL的LB broth中培养至600nm OD=0.5~0.6 : 再加入IPTG使最终浓度为1mM 刺激表达蛋白4小时收菌 : 以10000g离心30分钟， : 用50mL的buffer(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,1mg/mL Lysozyme,1mM DTT,0.2mM PMSF,1% Triton pH=8) : 将1L的菌 pellet冲起，冻入-80°C到隔天 : 冲水快速解冻後，冰上sonication 5分钟(on 30s off 30s，共10分钟) : 接着与1mL NTA-beads於离心管中摇晃binding 1小时 : 收集beads之後填入管柱中 : 接着以50mL的10mM imidazole,50mM NaH2PO4,300mM NaCl的buffer冲洗 : 再以30mL的20mM imidazole冲洗 : 再以20mL的30mM imidazole冲洗 : 再以10mL的40mM imidazole冲洗 : 再以10mL的60mM imidazole冲洗 : 接着以4mL的250mM imidazole elute : 收集清洗液40mM,60mM前面500uL 以及5管elute溶液 250mM 700uL跑胶 : 目标蛋白:红框里面，绿色及蓝色ladder中间那条，约30kD : 结果60mM看起来清洗掉很多杂蛋白但非常不纯 : 附图:左到右40,60,250,250,250,250mM imidazole : http://imgur.com/a/wlLg5 : 後来老师认为既然杂质蛋白太难洗掉，那降低pH值降低所有蛋白对NTA-beads的亲和力 : 反正含有His-tag的蛋白应该还是会牢牢的吸附在beads上 : 此外也不要摇晃binding 1小时，改用流过beads的方式binding就好，减少杂蛋白和beads作用的时间 : 因此新的条件将所有buffer改成pH=7.5 : 此外老师认为pH=7.5之下蛋白比较容易掉下来，所以清洗的gradient应该要改，盐类浓度也可以降低 : 所以imidazole洗到50mM就好，并且elute的NaCl浓度改成150mM : 後面elute改成各用1mL的60,80,100,120,140,250mM imidazole : 结果看来50mM清洗效果不佳，纯化的结果更加不纯 : 附图:左到右50,60,80,100,120,140,250mM imidazole : http://imgur.com/a/tkv0g : 小弟对於自己的情况有一些问题 : 首先老师表示: : 正常来说His-tag纯化 30mM imidazole浓度就应该会把杂质洗掉，再提高浓度会把目标蛋白也洗掉，一定是我的蛋白表现量不好 : 再来就是因为管柱是用人工填充的，也是手动控制流速，老师认为这样再现性本来就不佳，要我操作更加谨慎 : 但表现量是学姊已经测试过的，难道是後来我再做，冻在-80的菌株已经不健康了? : 另外我跟老师表示NTA-beads的protocol本来建议用pH=8,300mM NaCl进行实验，但老师认为protocol是死的，人是活的，不要太重视它 : 可是现在做了几次下来，都是原先的pH=8,300mM NaCl看起来效果最好 : 我又表示那如果我用2L的菌液去纯化，增加目标蛋白的总量去填满bead的空间使杂蛋白不易吸附，而且目标蛋白增加，也可以用稍高浓度的imidazole清洗，尽管目标蛋白有流失，最终也可以以量取胜 : 但老师认为如果我表现量不佳的话，就算增加表达的菌液培养量，目标蛋白占细菌总蛋白的比例还是不变，情况并不会有所改善 : NTA-beads是Qiagen的 : http://imgur.com/a/z7RfY : his-tag纯化已经是个很常见的方式了吧，想请问有做过的大大们这方面的经验如何呢?? 刚开始你的确是试了一些纯化条件，而无法解决问题 这时候，你要跳脱原先的思维，不然就被框架限制了 两个问题, 1. 你的target protein 是否有在纯化或是表现中降解？或是aggregated? 如果是这种情况发生的话，因为这些protein 可能都带有his tag 你怎麽调整 Ni column 纯化条件也是於事无补 如何得知？ 做个 western 即可确认 2. 你的target protein 是否有可能跟细菌内的其他蛋白质有interaction? 一旦这情况发生，杂蛋白质就是会随着你的target protein 被 eluted 出来 这时候就要考虑第二根 且不同类型的column， 而不是死卡在 Ni 纯化条件的调整 以我在国内外超过快二十年的纯化经验，BL21 内的内生性蛋白质 （所谓杂蛋白质）， 无以上两种情况，Ni column 都很好纯化出来。 good luck --

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