作者bbbnick (Nick)
看板Biotech
标题[讨论] Real-time PCR的电泳产物
时间Wed Feb 15 16:19:50 2017
有个实验问题想要请教一下版友~
最近做一些以Real-time PCR的同一类型的成分分析 (以Kit验)
结果:
1. Inhibition全部皆无抑制现像 (正常，Ct值无异常)
2. Reaction中NTC、NC如预期没有讯号(X)，PC有讯号(O)，待测物无讯号(X)
一时兴起将产物拿去跑电泳，
结果:NTC、NC无任何条带，PC、待测物在同一个位置皆有一个乾净的放大产物(~约150bps)
如果今天Real-time PCR有任何问题，Inhibition皆无任何抑制现像，且PC有明显讯号
可是电泳结果又很奇怪，PC及待测物有单一产物，但待测物於real-time PCR无讯号
请问何解? @@
PS: 将该待测物拿去验ELISA有检出蛋白质。 (表示含该成分相关蛋白质)
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 211.75.95.2
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1487146793.A.B62.html
1F：→ Ianthegood: 待测物是什麽 02/15 17:10
待测物是食品样本，要监定里面的成分
2F：→ a90648: 待测物胶的band跟PC比强弱如何? melting curve有讯号吗? 02/15 17:30
kit的PC强度较待测物弱很多，但还是看得到清楚的band，
方法是probe-based real-time PCR
3F：推 jabari: 定序啊 02/15 18:53
今天将PCR产物送定序了 XD
4F：→ lail: 你是用probe还是SYBR?再设计一对primer? 02/15 22:13
Probe-based real-time PCR喔!
因为kit是commercial kit，无法得知用的primer序列，
而且也不知道针对标的物的哪段基因，只知道针对该成分的ITS1基因
※ 编辑: bbbnick (114.39.176.167), 02/15/2017 23:54:54
5F：→ lail: 可以自己设计，自己合primer，不算贵 02/16 01:26
6F：→ lail: 有软体可以用，我觉得roche的系统都不错 02/16 01:27
7F：推 Ianthegood: 一个lane跑没跑pcr 纯的待测物看看 02/16 02:04
8F：→ a90648: 看来待测物的量应该不少，会不是会讯号太强被滤掉了? 02/16 11:15
9F：→ a90648: 我曾经遇过ct只有2~3，roche nano软体直接滤掉没data 02/16 11:17
10F：→ a90648: 後来调了exclude early cycle的值data就出来了 02/16 11:19
11F：→ a90648: 不过挼果真是这种情状我会建议dilute DNA後再跑一次 02/16 11:20
12F：→ a90648: 不过我是用SYBR 不确定probe system会不会有太强的问题 02/16 11:24
谢谢您的建议，今天试了稀释两个稀释倍率，Ct值与NTC、NC一样仍然是没有讯号Orz...
看来我先等定序的结果好了~
※ 编辑: bbbnick (211.75.95.2), 02/16/2017 16:33:45
13F：→ a90648: 如果是这样的话感觉是primer P到的不是probe bind的地方 02/16 16:40
14F：→ a90648: 那定序出来应该PC和待测物结果会不一样 02/16 16:41
可是电泳结果PC、待测物的扩增产物size一样 XD 怪怪的
就等定序出来再看看~ 谢谢罗!
※ 编辑: bbbnick (211.75.95.2), 02/17/2017 14:39:46
15F：推 aaaazzzz: 请问定序结果如何？应该出来了吧，我也很好奇 02/19 16:58
16F：→ bbbnick: 还没耶 XD 02/21 08:36
17F：→ bbbnick: 定序出来了，PC与Sample一样，不知道为什麽没讯号@@ 02/23 16:10
18F：→ a90648: 有qPCR signal的图和胶图吗? 02/23 16:38
21F：→ bbbnick: REF是同类型的参考物质 (理论上与PC同) 02/24 09:29
22F：→ a90648: 图看起来颇正常的阿@@ 还是改用SYBR试试? 02/24 11:52
23F：→ bbbnick: a大谢谢您喔! 我有机会再试试看 @@ 02/24 15:01
24F：推 cobraho: 好奇定序结果XD 02/25 01:12
定序结果出来了喔
REF(参考物质)与待测物序列相似度99% (只有中间几个硷基不同)
25F：推 ararthur: kit放多久了 我推测是probe坏了 从qPCR amp plot看curve 02/27 23:30
Kit还有半年效期，且Kit的PC没问题 @@
26F：→ ararthur: 理论上pc/sample应该是要跟ref平行比较合理吧 02/27 23:32
27F：→ ararthur: 不过也可能是根本P出奇怪的片段 即使跑出来band一样 但 02/27 23:33
28F：→ ararthur: 主要amplified产物并不是目标产物 所以probe可能hy得到 02/27 23:34
29F：→ ararthur: PC/ref 却hy不到samples 可以试着用那组primer配sybr 02/27 23:35
30F：→ ararthur: green跑看看 然後看melting curve 是否产物Tm不同 02/27 23:35
31F：→ ararthur: sequence出来 PC和sample一样都没讯号 很可能就是主产物 02/27 23:37
32F：→ ararthur: 根本不是你想要amplify的片段 02/27 23:37
有机会会用SYBR试试...
33F：→ a90648: 他有说sequence结果是一样的东西了 02/28 15:56
※ 编辑: bbbnick (220.130.231.117), 03/01/2017 09:31:13
34F：→ a90648: 会不会就是因为中间那几个硷基是probe binding site 03/01 11:49
35F：→ a90648: 所以导致待测物没讯号? 03/01 11:50
36F：推 Ianthegood: 不是吧 taqman做在3'端 贴不上去就没讯号不是? 03/02 18:04
37F：推 Ianthegood: 搞不好你的well挂了XD 换个well跑跑看 03/02 18:06