作者taya1991 (请叫我鸡头!)
看板Biotech
标题[求救] PCR 结果一直不理想或没东西
时间Thu Feb 16 13:49:46 2017
各问前被大大们好
目前被交代要做Genome typing
事情是这样的，LAB中有2批小鼠的染色体上，分别带有人类某A或某B gene的DNA
→cDNA的形式(没intron)，而且是homozygous
也就是A这批小鼠身上某条染色体上带了A gene
B这批带了B gene
-------------------------当然，这是厂商给的讯息--------------------------
那麽我现在要用PCR的方式去放大这个A gene 或B gene
由於A B两者相似度很高
所以在抽出老鼠的
genomic DNA之後，跑PCR要送sanger定序
问题来了，设计的primer包含reverse 和forward都有确定可以夹到这两个gene
但PCR出来的结果(2% agarose)，要不看不到东西，就是不亮
※我有夹这个gene的plasmid作为确认产物大小的control
A B gene大概长这样 → 111111111111111aaaaaaaaaaaaaa222222222222222222
两者中间大概有400bp左右是差异度比较高的，头尾几乎一样，总长大约1500bp
而primer是从头到尾都夹
taq：Qiagen Multiplex PCR Kit
在加入kit中的Q-solution(据说明是增加产物专一度)前，可以跑出淡淡的band
但在加了Q之後却跑不出东西来了，应该说让negetive跑出东西来而且跟有+DNA的一样亮
Genomic DNA 的量有用过10/50/100 ng 总体积都是25uL 结果都一样
我想问我要怎麽改变条件，才能让我的主产物更亮
才好用gel extraction後有够浓的DNA送定序
PCR的温度及时间：
淡淡band的一次
(拿别人用别的taq做的条件)
95-- 3min
95--30sec ─┐
58--30sec 35 cycle
72-- 1min ─┘
72-- 5min
依照我的taq修改...产物有band(不很亮)，但也出现其他不是产物的band
所以...实验室有人建议加Q-solution试试
95--15min
95--30sec─┐
58-- 1min 45cycle
72--30sec─┘
72--15min
加Q-solution後，就没东西了...
95--15min
95--30sec─┐
58--1.5min 55cycle
72--60sec─┘
72--10min
--
推 CCC：问：现在房间只有2.9度，请问这样的情况会不会下雪...
推 CCY：不会！墙角还有90度！
→ CCC：请问90度是华氏还是摄氏~
推 SBY：是a平方+b平方=c平方
推 WCC：所以躺在地上应该有180度?!
推 HKS：对~转一圈有360度~~多转几圈要几度有几度(((喂~~~
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 120.126.49.19
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1487224194.A.055.html
※ 编辑: taya1991 (120.126.49.19), 02/16/2017 13:50:43
※ 编辑: taya1991 (120.126.49.19), 02/16/2017 13:51:32
1F：→ blence: 如果primer是1.5kb重头到尾都夹,那2% agarose以及30sec的 02/16 14:12
2F：→ blence: extension就不是合理的条件 02/16 14:12
3F：→ blence: 这些在你用的Qiagen Multiplex PCR handbook也会有建议 02/16 14:14
B大，我重新补充了我试过的条件，我是打算回去用第二组不加Q-solution的
但还是想让主产物再更多
其他不是产物的band反正我可以切胶切掉这OK，有好建议吗？
※ 编辑: taya1991 (120.126.49.19), 02/16/2017 14:36:01
目前我的想法除了回到第二组的条件外(不加Q-solution)
就是拿跑过PCR的这些，拿一些出来再用相同的primer相同的condition再跑一次
(有番到某篇"增加PCR产物"的文)
但想到，若要做定序的话，好像要担心复制出错的问题？
还是其实OK就跑跑看也送定序看看？
目前我必须把这个条件确认下来，因为之後还有好几只老鼠要做确认 QAT
※ 编辑: taya1991 (120.126.49.19), 02/16/2017 14:53:14
4F：推 jabari: gradient PCR跟前後多设几对primer 就酱 02/16 15:14
5F：推 eric2853: 你的产物是1500 bp吗 是的话72度那步1分钟可能还不够喔 02/16 15:48
6F：→ eric2853: 30s 500bp 02/16 15:48
7F：推 patricksky: 72度C放长到1.5min 02/16 17:17
p大e大 好的 ！
8F：推 darrenyo: 跑到45跟55 cycle有点多欸 ... 02/16 17:39
9F：→ darrenyo: primer anealing 温度跑gradient 72度C 改1.5 min 02/16 17:40
10F：→ darrenyo: 并不是愈多Cycle就会愈好喔.. 02/16 17:40
Cycle 数确实我只是想增加产物，handbook是建议30~45cycle
11F：→ darrenyo: 另外你只是要genotyping的话应该不用考虑出错率的问题 02/16 17:41
12F：推 darrenyo: 错几个base不会影响你判断结果 02/16 17:49
OKOK 我会思考看看
13F：→ blence: 我是觉得为什麽你写的condition会跟handbook的差这麽多 02/16 19:35
14F：→ Ianthegood: 另外 干嘛跑到2% 1.5K跑1%就很够了吧 02/16 19:36
15F：→ blence: 既然都购买优化过的kit了,改条件前也先参考default吧？ 02/16 19:37
了解，我会以default+建议的annealing温度重新来 thanks
16F：→ Ianthegood: 还有ng level的template跑超过35个cycle大概只会把你 02/16 19:37
17F：→ Ianthegood: 的产物烧坏... 02/16 19:37
I大 handbook是建议30~45个cycle ...
※ 编辑: taya1991 (61.230.91.19), 02/16/2017 20:50:44
18F：推 jabari: 对了 难道你不能去跟厂商要他们genotyping的method吗？ 02/16 21:00
19F：→ jabari: 说homo就真的homo @w@? jax的鼠儿吗？ 02/16 21:00
我了解你的意思，but......事情没这麽单纯，有点复杂...痾...这应掰不方便公开说((?
恩......
总之我会需要建立这套系统的~
※ 编辑: taya1991 (61.230.91.19), 02/16/2017 22:14:22
20F：推 jabari: 了解 =.,= 那只好教个秘招...用R牌的probemaster 跑PCR... 02/16 23:22
21F：→ jabari: 可能会有你要的片段大小 可惜含dUTP.. 如果有产物的话再 02/16 23:22
22F：→ jabari: 想办法跑nestPCR定中间片段 02/16 23:22
23F：→ Ianthegood: appendix C看一下好吗 02/17 00:12
24F：→ WinnieDad: 梯度PCR跑一次，找最佳黏合温度看看。 02/18 11:19
25F：→ qazbamboo: Primer 大小？ 02/19 01:21