作者helen82323 (弦)
看板Biotech
标题[求救] internal control band粗度差很多
时间Thu Feb 23 13:05:28 2017
抽活体组织蛋白质，也用BCA测浓度，但是每次跑western的internal control都不是一样
粗
我是做不同发育时间点的该组织表现量，然而每次都是发育早期的两三个时间点internal
c
我用的control是B-actin
补充一点，因为被这个问题困扰很久，有测过用lysis buffer稀释sample和用ddH2O稀释s
am
我的sample是WT，没有任何处理
请问这个问题要怎麽解决？？？
--
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1F：→ Bows: 换一个internal 试看看02/23 13:28
2F：推 darrenyo: 简单叙述一下从抽蛋白质到跑Western前的Sample处理?02/23 16:34
3F：→ darrenyo: 这样大家比较好帮你看看是不是哪里有问题?02/23 16:35
4F：→ Ianthegood: data永远是对的02/23 22:11
蛋白质是用lysis buffer抽的，proteinase inhibitor都是现加，抽完放冰上十分钟，4
度C
测浓度是将蛋白质用lysis buffer(现在改用ddH2O)做25倍稀释，然後用BCA的kit测，根
据?
western的步骤我也说一下：每一个well load 80ug的蛋白质+10uL深蓝色臭臭的buffer，
胶
真的不知道差异是哪一步造成的，已经做了好多组都是这样，而且sample算珍贵，如果换
in
※ 编辑: helen82323 (118.160.92.128), 02/24/2017 00:46:24
5F：推 Bows: internal 虽然是稳定表现，但在某些极端条件下还是会跑掉02/24 02:11
6F：→ Bows: 先确定不是internal表现跑掉的问题吧02/24 02:12
7F：→ Bows: 如果是就一定要换了02/24 02:12
8F：推 tz2733: 在发育时间较晚的sample 因其他非actin蛋白产量变多了02/24 11:00
9F：→ tz2733: 所以测浓度loading等量蛋白跑胶後 actin比较淡(占比少)02/24 11:00
10F：→ tz2733: 不是正常吗? 纯粹我的猜想02/24 11:00
11F：→ Bows: .....如果是本身actin在前後期会改变表现量那就代表actin在02/25 02:21
12F：→ Bows: 这里是不能当作internal即使你硬是自己乱调，得到的结果也是02/25 02:21
13F：→ Bows: 假的，还在那里纠结全部重做？02/25 02:21
14F：→ Bows: 已经好声好气的说了，如果你不听也没人会想理你02/25 02:22
15F：→ Bows: 若是每次做的结果actin都是在某个时间点增加/减少，那你第一02/25 02:25
16F：→ Bows: 件事情必须是确认actin的表现量跟其他常见非细胞骨架的inter 02/25 02:25
17F：→ Bows: nal做比较，去确定actin是否为稳定的internal02/25 02:25
18F：推 elelith: 不同发育阶段的internal control表现不一样很正常...02/25 07:47
19F：→ elelith: 如果你是要量化 试试用ponceau然後用整行(total loading)02/25 07:48
20F：→ elelith: 去normalize02/25 07:48
21F：推 Ianthegood: 他都先用loading量normalise了啊02/25 19:54
22F：推 tynse71864: 我同意 ele大的做法～ 做完 wb後用立春红染一染看总蛋 03/02 19:17
23F：→ tynse71864: 白量03/02 19:17
不好意思，实验室目前没有立春红，但有需要的话会买。我想请问染立春红後要如何定量
? 如何呈色让机器能够侦测? 真的不太懂..谢谢
※ 编辑: helen82323 (220.136.197.16), 03/07/2017 01:34:59
24F：→ Ianthegood: 把最上面那串western看完再说 03/07 20:22
我跟隔壁实验室借GAPDH来测试了，原本的actin真的不适合在我的sample当internal con
trol，现在只能换internal全部打掉重来了，很多组sample都没了要等老鼠，过去白白牺
牲了很可观的时间跟老鼠，虽然很痛苦，但是找到问题症结点真的是非常感谢各位的提点
。
※ 编辑: helen82323 (223.140.105.217), 03/07/2017 23:58:02