作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
标题[求救]
时间Sun Mar 5 18:34:21 2017
各位好， 手机排版请多见谅:
想请问有没有做过 cell fractionation的实验的版友呢?
由於 lab无人做过， 因此是自己按文献的步骤进行 :
我的实验有 wt跟 ko组， 想比较ko A蛋白後对於B 蛋白 (在 ER及 Gol)内的影响, 有试过 sucrose/optiprep gradient
这边是材料与方法:
1.收集老鼠的小肠细胞於PBS中
2.将细胞以10mM HEPES,pH7.4 进行swelling (冰上5分钟
3.加入2X的lysis buffer (最後浓度为10mM HEPES,250mM sucrose, 1mM DTT, protease inhibitor (1XPI)
4.使用tight-fit dounce homogenizer 磨30下 (冰上,约5分钟)
5.cfg 1900g 10min (离掉unbroken cell跟核)
6.取上清, cfg 100000g 1h
7.此时上清应为cytosol protein, pellet为microsome (ER/Gol等)
8.将pellet 溶於250mM sucrose 中 (含10mM HEPES,1mM DTT, 1XPI),并滴於20~56% sucrose gradient上
9.cfg 39000rpm 18h (rotor:SW41Ti)
10.由上至下以pipetman取1ml,收集12个fraction
11.取部分做western blot, 并压ER/Gol的 marker
目前的问题是， 我的 ER 跟Gol两个部分分不开， 导致我无法比较两者之间的差异
(按照文献,Gol 约 fraction# 3-5, er# 6-12; 但我的做出来总是gol# 3-6, er 2-12)
https://goo.gl/Z5yRzd
(图中我的gol还是会到後面...但大部分都在45之间,後面几次实验 Gol就比较集中在4~5
可ER每次都会从2~12)
已经试了快半年了仍然没什麽进展， 也已经向不同 protocol的作者询问细节，
仍然是无法解决， 因此想上来问问是否有做过类似实验的版友可提供意见呢? 谢谢!
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Sent from JPTT on my Sony E5653.
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 111.83.135.57
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1488710064.A.5D6.html
1F：推 alaric: 先找你的指导教授讨论吧. 找人检查你的方法流程. 03/05 21:56
老板本身没有做过相关实验;我跟他讨论了很多次,也试了6次左右,仍无法解决
我有跟做类似实验的国外作者们通信过, 给的资讯有改善部分结果
2F：→ Ianthegood: 然後你的方法材料都不明不白 板友如何隔空抓药 03/05 22:32
抱歉发文当时无资料,已补上
3F：推 Ianthegood: 首先是你压的marker跟作者的不一样啊 cnx那只的signat 03/06 01:38
4F：→ Ianthegood: ure就差没有太多 然後你如果要看两个胞器内的差异你就 03/06 01:38
5F：→ Ianthegood: 抓几个最纯的fraction同时压你的protein还有golgi跟er 03/06 01:38
6F：→ Ianthegood: 的marker当作standardisation就可以了吧 03/06 01:38
7F：→ Ianthegood: 要收到纯的胞器可以说是不可能 03/06 01:39
Syntaxin6是家里刚好有顺便压一下
MTP在原文献中也是作为ER marker (位置同GRP94)
https://goo.gl/eUUhp6
这是其他次实验的结果
应该说我的实验结果会飘...也无法像paper一样分的那麽好
8F：推 Ianthegood: 因为dounce本来就是irreproducible啊XD 加上你samplin 03/06 18:32
9F：→ Ianthegood: g用pipet 我们家在分gradient都用快停产的机器在分才 03/06 18:32
10F：→ Ianthegood: 能ensure reproducibility 03/06 18:32
我知道有蛮多用nitrogen bomb,但也是很大部分用Dounce?
我们家是有分gradient 那台机器, 只是管子必须用polyallomer的
目前手上全都是ultra clear戳不了洞QQ
※ 编辑: tynse71864 (203.71.62.165), 03/07/2017 11:40:03