作者yvette26 (小轩)
看板Biotech
标题[求救] WB internal control 定量问题
时间Mon Mar 6 13:49:56 2017
其实是我们家另一个助理到别人家去学回来的protocol，
但是在一开始定量的部份让我想破头都不确定逻辑通不通...
希望能有高手帮忙解惑，谢谢~
我们家跑WB前会先把sample用分光光度仪，595 nm测吸光值後，
算好个别浓度，再决定每个well要loading的量。
别人家是不测吸光值，
第一次都先直接loading一样多的sample，然後直接跑internal control (tubulin)，
跑出来的结果去反算sample应该要loading的量，
所以第二次可能每个well sample量都不一样，但internal control是一样的。
虽然乍看之下好像没甚麽大不了，但是总觉得...不够严谨?
对方的解释是说，他们觉得以internal control为标准就可以了，
但如果sample个别本身的internal control就有差异了呢?
还是这已经是可以通用的规则，internal control就能当标准化使用?
如果已经是通用标准的话我想就接受了，不然还是回来遵循老方法吧...
希望有人可以跟我讨论，谢谢~
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 36.233.2.209
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1488779404.A.85D.html
1F：→ a90648: internal control会有变化的话就不能这当internal control 03/06 13:52
2F：推 huangsw: 先说你的材料来料是啥? 那你用595nm测的原因是? 03/06 14:22
3F：推 huangsw: 推a大的 internal control不应该有差异 03/06 14:36
4F：推 qiet: 第一次听到有人这样算, 不觉得很浪费时间吗, 要跑两次胶ㄟ 03/06 16:43
5F：→ tz2733: 你有找到一篇paper是这样写就知道可不可以啦~ 03/06 18:05
6F：推 darrenyo: 不管怎样在正常情况下你的Data的 internal control 03/06 18:19
7F：→ darrenyo: 都要一样啊 所以理论上不管是用哪个方法最後结果都一样 03/06 18:20
8F：→ darrenyo: 只是你定量可以订的准的话就不用多跑一次啦 03/06 18:20
9F：推 darrenyo: 只是不太懂你测595nm是? protein assay的结果吗? 03/06 18:23
10F：→ Ianthegood: 595是bradford吧 03/06 18:35
11F：推 Ianthegood: internal control不是本来就该当作standardisation? 03/06 18:40
12F：→ Ianthegood: 不然你在paper里看到每个lane的actin一样粗是怎麽做 03/06 18:41
13F：→ Ianthegood: 的? 03/06 18:41
14F：→ blence: actin一样粗有不同方法阿,前定量-assay OD;後定量-试跑胶 03/06 18:47
15F：→ blence: 或者复制贴上(误)；一般都是采前定量,而不是原po的後定量 03/06 18:47
16F：推 tz2733: 好奇原po说的这种方法 第二次跑出来的internal control真 03/06 20:55
17F：→ tz2733: 的会一样吗? 03/06 20:55
18F：→ Ianthegood: 就试跑当作前定量罗 应该真的会一样粗吧 03/06 21:05
19F：→ raiyu: 有听过 前助理他硕班的实验室是这样"定量"的 (虽然我觉得有 03/06 21:26
20F：→ raiyu: 点...作假的感觉...我个人感觉啦 03/06 21:27
21F：→ Ianthegood: 怎麽会 都是在算target protein跟standard的相对量啊 03/06 21:36
22F：→ Ianthegood: qPCR不是也这样算 03/06 21:36
23F：→ raiyu: 定"蛋白"跟定"图片"的差异 呈现的结果可能一样但定义不同 03/06 21:51
24F：→ a90648: 但是图片反映的是蛋白的量阿!哪有不同? 03/06 23:19
25F：→ a90648: 那照你的说法qPCR不就定萤光强度和定RNA量的差异? 03/06 23:20
26F：→ Ianthegood: r是觉得一定要某个机器给你一个数字才是准的吗XD 你去 03/07 03:22
27F：→ Ianthegood: 看看bradford的manual给的范例bsa跟lysozyme的浓度/吸 03/07 03:22
28F：→ Ianthegood: 光值比差多少 03/07 03:22
29F：→ raiyu: 我就说我个人"感觉"了啦 03/07 12:50
30F：→ raiyu: 因为有遇过药是会影响tubulin的 当然就必须用别的internal 03/07 12:56
31F：→ raiyu: control了 但如果在一开始不知道的情况下直接以此方法定量 03/07 12:57
32F：→ raiyu: 的话会有miss 当然也可以一开始第一次就把所有能当internal 03/07 12:58
33F：→ raiyu: control的蛋白都压一遍啦~~~~(摊手) 03/07 13:00
34F：→ raiyu: 回I大 图片出来不是也有一个值吗XDDDDDDD 03/07 13:05
35F：→ raiyu: 总不会是用眼睛看吧 不然定出来後如果不同要怎麽调整??XD 03/07 13:10
36F：→ raiyu: 总要有依据吧XDD 03/07 13:12
37F：→ raiyu: 回a大 是呀 是以萤光强度代表RNA量 不是吗??(抓头) 03/07 13:29
38F：→ a90648: 所以在使用的internal control没问题的状况下 03/07 20:18
39F：→ a90648: 图片就代表蛋白量啦 03/07 20:18
40F：推 tz2733: Western Blot Normalization: 03/08 16:04
41F：→ tz2733: Challenges and Considerations for Quantitative Analysi 03/08 16:04
42F：→ tz2733: s 03/08 16:04
43F：→ tz2733: 有空可以找一下这篇 有原po你说的标准方法 还有Normalizat 03/08 16:04
44F：→ tz2733: ion的方法 可能可以帮助你 03/08 16:04