作者yvette26 (小轩)
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标题Re: [求救] WB internal control 定量问题
时间Mon Mar 6 23:09:24 2017
前文删光光
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1F：→ a90648: internal control会有变化的话就不能这当internal control 03/06 13:52
2F：推 huangsw: 先说你的材料来料是啥? 那你用595nm测的原因是? 03/06 14:22
3F：推 huangsw: 推a大的 internal control不应该有差异 03/06 14:36
我的材料来源是大鼠的脊髓，做的是有关神经损伤的部分，
因为在取sample的时候，每只不可能取到一样重的脊髓，
所以如下blence所说，之前学的都是前定量，用595 nm波长去测OD值，推算回蛋白浓度。
我知道理论上internal control是要够准才能当internal control，
但是我从一开始的sample量就不会一致了，
所以...後定量也是可行的?
推
qiet: 第一次听到有人这样算, 不觉得很浪费时间吗, 要跑两次胶ㄟ 03/06 16:43
4F：→ tz2733: 你有找到一篇paper是这样写就知道可不可以啦~ 03/06 18:05
paper好像都不会写到如此详细的步骤...
5F：推 darrenyo: 不管怎样在正常情况下你的Data的 internal control 03/06 18:19
6F：→ darrenyo: 都要一样啊 所以理论上不管是用哪个方法最後结果都一样 03/06 18:20
7F：→ darrenyo: 只是你定量可以订的准的话就不用多跑一次啦 03/06 18:20
8F：推 darrenyo: 只是不太懂你测595nm是? protein assay的结果吗? 03/06 18:23
9F：→ Ianthegood: 595是bradford吧 03/06 18:35
10F：推 Ianthegood: internal control不是本来就该当作standardisation? 03/06 18:40
11F：→ Ianthegood: 不然你在paper里看到每个lane的actin一样粗是怎麽做 03/06 18:41
12F：→ Ianthegood: 的? 03/06 18:41
13F：→ blence: actin一样粗有不同方法阿,前定量-assay OD;後定量-试跑胶 03/06 18:47
14F：→ blence: 或者复制贴上(误)；一般都是采前定量,而不是原po的後定量 03/06 18:47
所以这两种的确都是通行的定量方法?
15F：推 tz2733: 好奇原po说的这种方法 第二次跑出来的internal control真 03/06 20:55
16F：→ tz2733: 的会一样吗? 03/06 20:55
目前看来是差不多的。
17F：→ Ianthegood: 就试跑当作前定量罗 应该真的会一样粗吧 03/06 21:05
18F：→ raiyu: 有听过 前助理他硕班的实验室是这样"定量"的 (虽然我觉得有 03/06 21:26
19F：→ raiyu: 点...作假的感觉...我个人感觉啦 03/06 21:27
20F：→ Ianthegood: 怎麽会 都是在算target protein跟standard的相对量啊 03/06 21:36
21F：→ Ianthegood: qPCR不是也这样算 03/06 21:36
22F：→ raiyu: 定"蛋白"跟定"图片"的差异 呈现的结果可能一样但定义不同03/06 21:51
我就是不确定如此，因为虽然结果可能一样，但定义不同。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 59.126.51.113
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※ 编辑: yvette26 (59.126.51.113), 03/06/2017 23:11:21
23F：→ a90648: internal control就是会跟着你的组织量多就多少就少 03/06 23:23
24F：→ a90648: 才叫做internal control啊! 03/06 23:23
25F：推 a90648: 举个例子semi-qPCR 不就是跑胶根据 internal control 03/06 23:29
26F：→ a90648: band的强弱进行调整吗? 03/06 23:29
27F：→ a90648: 照你的说法，以前paper上用semi-q的都有问题罗? 03/06 23:31
不好意思...我没有做过semi-qPCR...所以这段例子我真的看不懂...
28F：推 hsnuyr: 我觉得问题在所选的internal control是不是真的不会随着 03/06 23:49
29F：→ hsnuyr: 实验条件变化 03/06 23:49
30F：→ a90648: 没错!! 能这样做的前提就是在这边 03/06 23:51
31F：推 hsnuyr: 我们就有实验同一个sample同时压GAPDH和tubulin结果却不一 03/06 23:52
32F：→ hsnuyr: 样，所以使用後定量的前提我觉得是要先能证明使用的intern 03/06 23:52
33F：→ hsnuyr: al control真的不会随实验变因而变化 03/06 23:52
34F：→ hsnuyr: 但是这样很辛苦就是，学弟妹被我要求一个sample要跑三种in 03/06 23:53
35F：→ hsnuyr: ternal control哈哈哈 03/06 23:53
36F：→ a90648: 这算是很严谨的做法啦XD 03/06 23:54
37F：推 darrenyo: 所以你先定量完下去跑的结果internal control到底一不一 03/07 00:53
38F：→ darrenyo: 样啊? 03/07 00:53
啊，我忘记补充了，
这两种方法操作下，跑出来的internal control都是差不多的。
※ 编辑: yvette26 (59.126.51.113), 03/07/2017 03:00:16
39F：→ a90648: semi-q 简单来说就是cDNA pcr完之後跑胶,根据internal con 03/07 09:09
40F：→ a90648: trol的强弱来调整pcr cycle数，将大家internal control调 03/07 09:09
41F：→ a90648: 成一样强来比较target gene表现量的多寡 03/07 09:09
42F：→ yvette26: 感谢a90648~ 03/07 13:13
43F：推 darrenyo: 那如果这样我认为用你原本的方法就好 没必要多跑一片胶 03/07 23:43
44F：→ darrenyo: 但是就如同其他版友讨论第二种方法也没甚麽不对 03/07 23:44
45F：推 darrenyo: 有些时候某些样品会遇到定量定不准的状况.. 03/07 23:48
46F：→ darrenyo: 就可能可以考虑用第二种方式 03/07 23:48
47F：→ a90648: 基本上该说的大家也说得差不多了，而原PO也说了两种做法 03/09 00:10
48F：→ a90648: 得到的结果是差不多的，後定法是否真的有问题 03/09 00:11
49F：→ a90648: 就让大家自己做判断了 03/09 00:11
50F：→ a90648: = = 推错篇... 03/09 00:12