作者tz2733 (这就是人蔘呀~)
看板Biotech
标题Re: [求救] WB internal control 定量问题
时间Tue Mar 7 17:47:19 2017
跟老板讨论了一下这种方法是否可行
老板说不行...
试着分享提到的几个观点
1.WB经过一抗二抗呈色出来的不是线性放大
所以此法不可行
(此外 我个人的经验是 单单是曝光时间不同两个band之间的倍数差异就会不同 可能1:2
变成1:1.8之类)
2.蛋白质浓度定量是用某胺基酸(依不同方法而不同胺基酸 这生化有教)来标准化sample
internal control则是一种蛋白质 当然是前者比较能正确标准化sample
(我表达的词可能不是很正确但希望提出来大家想一想)
3.会出现这种方法可能是因为收组织样本品质不一造成internal control band会粗细不
一 所以才用这种方法掩盖样品收集的问题
(例如有无灌流完全 周边的脂肪组织是否有去除等都会造成internal control在等量prot
ein跑WB band粗细却不同 )
所以我建议原PO还是别用这种奇特的方法跑WB吧....
paper多数都会写loading多少量的total protein 所以都是有测蛋白质浓度後等量去跑
的吧...
大家参考~
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 111.71.78.38
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1488880042.A.25E.html
1F：→ a90648: 1.但是大家都是1:2变1:1.8 对相对定量来说不影响03/07 18:10
2F：→ blence: 第1点不太同意,因为assay也会有倍数差异情况,关键在讯号饱03/07 18:19
3F：→ blence: 合度;不要把paper那种又大又肥的band拿来比喻 03/07 18:20
4F：→ blence: 第2点,浓度是测特定AA而已,严格说也无法代表蛋白质含量阿03/07 18:20
5F：→ blence: 第3点,虽然我看过以特定蛋白质来定量的paper不超过五篇,但03/07 18:20
6F：→ blence: 但至少也真的有方法这麽做;而文字上也可以用reference03/07 18:21
7F：→ blence: 蛋白的量来呈现target蛋白的量,说明清楚即可 03/07 18:21
8F：→ blence: 而类似的例子也有phospho/total protein的描述方式03/07 18:22
9F：→ blence: 另外我不觉得paper特别偏好load ug数,如果是干嘛秀control 03/07 18:24
10F：→ Ianthegood: 回完了才发现b大都讲完了XD03/07 18:44
11F：→ blence: 你写的比较清楚完整阿03/07 19:33
12F：→ tz2733: 请问b大说的"那干嘛秀control"是指internal control的图03/07 20:00
13F：→ tz2733: 吗?还是指control组?03/07 20:00
14F：→ tz2733: data不是要用除internal control後的ratio来计算 ? 03/07 20:07
15F：→ Ianthegood: 除下去就也是normalisation啊XD03/07 20:10
16F：→ tz2733: 所以我以为要秀internal control图的用意是因为ratio~ 如03/07 21:12
17F：→ tz2733: 果说两组别照原po方法第一次internal control 不同曝光後03/07 21:13
18F：→ tz2733: 计算是1:2或1:1.8,那第二次跑胶是sample改成要loading量 203/07 21:13
19F：→ tz2733: :1或1.8比:1 这样对要看的蛋白的"组间"差异不会有影响吗?03/07 21:13
20F：→ tz2733: 如果这个蛋白组间差异小2:1或1.8:1 可能就看不出来到底03/07 21:13
21F：→ tz2733: 有没有差别了吧 所以我才会提出这个经验来讲 但不知想的03/07 21:13
22F：→ tz2733: 对不对 03/07 21:13
23F：→ blence: 别管原po的方法了;在第1点,你(或老师)认为测浓度定量比较03/07 21:30
24F：→ blence: 准确可行吧？ 那你们的paper是不是只需要写放多少ug就好,03/07 21:30
25F：→ blence: 不需要放actin,tubulin这些internal control了吗？ 03/07 21:30
27F：→ a90648: 有错的话，麻烦帮忙修正一下谢谢03/07 21:31
那为何要跑第二次?
28F：→ blence: 倒数第二行的B/IB应该改成Tb/Ib更有一致性03/07 21:37
我上面讲的同次操作曝光造成的差异不是你举例的情形
32F：→ tz2733: 回覆 blence 我们是觉得原po方法这样反推不可行 不是觉03/08 00:20
33F：→ tz2733: 得只要订量蛋白就可以了 正规是用同样ug下去跑WB 然後观03/08 00:20
34F：→ tz2733: 测的特定蛋白再除internal control得到ratio值 再去比较03/08 00:20
35F：→ tz2733: 组间ratio值差异 paper一般看到也是说明多少ug 然後也会03/08 00:21
36F：→ tz2733: 有hy internal control 所以应该是跟我们一样做法 如果是 03/08 00:21
37F：→ tz2733: 用原po反推法的 根本就不会写出是用多少ug 因为没测protei03/08 00:21
38F：→ tz2733: n浓度呀03/08 00:21
39F：→ Ianthegood: 你除下去不就是用internal ctrl在做normalisation03/08 00:32
40F：→ Ianthegood: 而且最可能的情况是他跑第一片胶前就测过浓度了03/08 00:33
41F：推 darrenyo: equal amount 也是常见的写法啊 更何况有些根本没写03/08 00:36
42F：→ blence: 文中对於以internal control作为normalizatio的不置可否03/08 00:38
原po文
"别人家是不测吸光值，
第一次都先直接loading一样多的sample，然後直接跑internal control (tubulin)，
跑出来的结果去反算sample应该要loading的量，
所以第二次可能每个well sample量都不一样，但internal control是一样的。"
我是对用internal control的band去定量作为取代蛋白质浓度测定不同意 不是你说的这
样意思
43F：→ blence: 我只是以实际状况提出反证03/08 00:39
44F：→ blence: 你用浓度ug去定量再用internal,最终还是依照後者为主阿 03/08 00:39
45F：→ blence: 以达到一致loading的data呈现,internal还是比ug令人信服03/08 00:43
46F：→ a90648: 可用的internal control就是可以忠实的反映loading蛋白量03/08 00:46
47F：→ a90648: 蛋白浓度高internal control就多反之亦然 03/08 00:46
internal control是反应蛋白质总量还是反应细胞量?
48F：→ blence: 对於原po的後定量,实际操作或许会遇到需要2~3次测试03/08 00:47
49F：→ blence: 来达到一致laoding量,因此我不认为会比你的方法还不可行03/08 00:47
50F：→ blence: 当然,这种方法太麻烦厚工是缺点,我自己也不那麽做03/08 00:48
51F：→ a90648: 忽然想到!! 现在的问题会不会是t大没弄清楚他所说的 03/08 00:58
52F：→ a90648: 特定蛋白再除以internal control得到ratio值03/08 00:59
53F：→ a90648: 这个步骤所代表的意义是甚麽?03/08 00:59
我知道ratio是什麽意思啦~应该说我觉得等量蛋白跟normalisation不相等 所以定量跟in
ternal control都要做 定量还有其他意义 像看loading的蛋白量是否合适之类的 例如有
些特定蛋白可能细胞组织要多一点量才能hy出来 这在看paper时就会参考到 我诠释原原p
o说从别家学回来的方法是"不测浓度的" 但受限於internal control的band实在容易很亮
根本超过与蛋白量的线性关系 且大家都说该方法可行前题是internal control是稳定不
受影响的 那原原po这样反推让其internal control"做"成相等 不就怪怪的? 我不是在说
用internal control作normalisation不行呀呀呀~~~
※ 编辑: tz2733 (42.73.245.230), 03/08/2017 08:22:01
54F：→ a90648: 再用同体积lysis buffer收蛋白的情形下细胞多蛋白就多 03/08 09:54
55F：→ a90648: 而在用不同体积收蛋白的情形下，浓度高，control也会高03/08 09:57
56F：→ a90648: 不论是订浓度跑还是订control再跑一次，你所使用的control 03/08 09:58
57F：→ a90648: 一定要是稳定不受影响的，这是一定要遵守的条件 03/08 09:59
58F：→ a90648: 取同样量的蛋白但跑出的control却差很多 03/08 10:00
59F：→ a90648: 这个control就不能用 03/08 10:01
60F：→ a90648: 而後定法就是利用internal control作normalization 03/08 10:02
61F：→ a90648: 但是这方法至少要多跑一次胶，也要注意band是否过曝之类的03/08 10:03
62F：→ a90648: 相对於一开始就测浓度要注意的地方更多更麻烦 03/08 10:04
63F：→ a90648: 我也是一开始就乖乖测浓度去跑就好了 03/08 10:04
64F：→ a90648: 但不代表这样做就是错的 03/08 10:05
我的想法是这样的 WB主要目标是想知道细胞内某蛋白表现量变化 但因实务上的限制 无
法求得单一颗细胞的蛋白表现情形 所以改以测protein assay去看等量蛋白下某蛋白的表
现 量 而internol control则是当操作ok时 应该会出现相似表现量的结果 但可能甲inte
rnol control会变化 所以换乙 计算data 这是要去normalize细胞数及一些操作上的小问
题 如果照你认为可行的後定量依internal control去回推调整sample loading量 那这层
意义就消失了 WB追求且必要的并非internal control一致 那是操作ok伴随可能会出现的
现像 且因需要作normalize而有ratio的计算
65F：→ a90648: 而且是原PO家的助理不是原PO这样做啊XD 03/08 10:08
66F：→ blence: 当以internal cont做normalize,就暗示了load sample不同量 03/08 10:54
67F：→ blence: 你以internal control做normalizsation,就等同把internal03/08 11:01
68F：→ blence: "做"成相等的意思;如果你认为不该做成相等,那测完浓度後03/08 11:01
69F：→ blence: 直接跑胶,定量target就可当成表现量,何需要除以internal呢 03/08 11:02
70F：→ blence: 实际上的操作我常常像你的做法,但在叙述上,normalisation03/08 11:06
71F：→ blence: 跟"做成相等",被你当成认定是不同意义,这点我不认同 03/08 11:08
我也思考了一下为何我觉得不同 我发现我觉得不同的应该是 等量跑胶+internal contro
l normalisation(ratio)与直接用不等量跑胶定internal control band +回推比例loadi
ng这两者不同 这两者不同的地方在於有测浓度等量去跑可以说是稳定实验操作品质
的方法之一 (跟normalisation不同) 而後者方法要可行的前题限制太多 这样的手法是
否会带来实验品质的变异性增大? 这是两者间的不同 不是单用计算或推理出来可说两者
相等的 如果真要用後订法 是否先跑胶染total protein去做sample的调整比单看单一 in
ternal control 合宜? 我找了网路资料试着厘清自己的想法"Western Blot Normalizati
on:Challenges and Considerations for Quantitative Analysis" 可以看4的部份 标
准方法一直没变过 只有後面normalization的计算法不同 这是我粗略看过去的心得
※ 编辑: tz2733 (42.73.245.230), 03/08/2017 12:40:47
※ 编辑: tz2733 (42.73.245.230), 03/08/2017 14:23:58
72F：→ blence: 我不认同"WB追求且必要的并非internal control一致....... 03/08 14:47
73F：→ blence: 後面那一段话,也不认同"需要作normalize而有ratio的计算" 03/08 14:48
74F：→ blence: 原因1.你就秀不一致的internal control,再看paper买不买单 03/08 14:49
75F：→ blence: 原因2.如果仅是需要normalize,何必还去跑internal cont.03/08 14:51
76F：→ blence: 你以ug就去normalize就好,每个lane有多少ug都被固定了阿
03/08 14:52
77F：→ blence: 而且,你也提到,当甲蛋白会受到实验变化时会,改用乙蛋白 03/08 15:00
78F：→ blence: 不就暗示对你而言,用ug总量就好,internal cont.完全不用跑
03/08 15:00
79F：→ a90648: 依internal control去回推调整sample loading量03/08 15:12
80F：→ a90648: 就是你所说的normalization阿!! 只是前定量是计算出数值 03/08 15:13
81F：→ a90648: 而後定试是反映到loading量去实际有动作的调整 03/08 15:14
82F：→ a90648: 而在前定量出现甲不一致改用乙计算时 03/08 15:15
83F：→ a90648: 後定量当然也是要跟着用乙阿!! routine的实验中哪个 03/08 15:16
84F：→ a90648: control可用这是已知的是，前後定量不会有差异 03/08 15:17
85F：→ a90648: 但在第一次做实验时，一定会看复数个control才能知道 03/08 15:18
→ a90648: 哪个是可用的，这在前後定量都是一样要做的事情
03/08 15:19
如果有空可以看一下我上面提的那篇 "Western Blot Normalizati
on:Challenges and Considerations for Quantitative Analysis"
我大概就回覆到这里了
※ 编辑: tz2733 (42.73.245.230), 03/08/2017 15:58:39
86F：→ a90648: 你举的同次曝光时间不同造成的差异，当1:2变成1:1.8时 03/08 23:52
87F：→ a90648: 代表已经过曝啦 请降低曝光时间 03/08 23:53
88F：→ a90648: 至於我举的例子为什麽要跑第二次，第一次的结果 03/08 23:53
89F：→ a90648: control粗细差了两倍，虽然相对定量的结果不会变 03/08 23:54
90F：→ a90648: 但是请问投paper时会放这种图吗? 03/08 23:54
91F：→ a90648: 至於你提到的那篇的第4.2最後两行就是再说後定法罗 03/09 00:04
92F：→ a90648: 但就如前面大家提到的，internal control的选择是很重要的 03/09 00:05
93F：→ a90648: 当然里面提到用Coomassie staining去看loading是否准确 03/09 00:06
94F：→ a90648: 也是可以的 03/09 00:06
95F：→ a90648: 虽然里面是说去确认测的蛋白浓度是否准却 03/09 00:08
96F：→ a90648: 而後定法就是类似的作法只是少了一开始的测量浓度 03/09 00:09
97F：→ a90648: 基本上该说的大家也说得差不多了，而原PO也说了两种做法 03/09 00:12
98F：→ a90648: 得到的结果是差不多的，後定法是否真的有问题 03/09 00:13
99F：→ a90648: 就让大家自己做判断了 03/09 00:13
100F：→ raiyu: 总算有心力来认真看一下&提一下我的疑问点 03/11 21:52
101F：→ raiyu: WB的比较是在同一个基础下去做比较的吧 前定量法loading时 03/11 21:54
102F：→ raiyu: 就是loading相同的蛋白量(不论定得准不准) 所以比较点是在 03/11 21:55
103F：→ raiyu: 相同蛋白量上去做比较 那看paper的人要怎麽知道你是真的同 03/11 21:56
104F：→ raiyu: 蛋白量呢? 所以我们会放所谓的internal control来显示我是 03/11 21:57
105F：→ raiyu: loading一样的蛋白量 所以internal control只是用来证明我 03/11 21:59
106F：→ raiyu: 是loading一样的证据 03/11 22:00
107F：→ raiyu: 那後定量法 在我的感觉上 变成我loading的是"相同tubulin 03/11 22:01
108F：→ raiyu: 量(or其他internal control) 这2者虽然看起来一样但定义 03/11 22:02
109F：→ raiyu: 不太一样吧??? 有点像白马非马 03/11 22:03
110F：→ raiyu: 虽然在实际操作时 我要看我定量定得准不准也是看压出来的 03/11 22:06
111F：→ raiyu: internal control.....= =|| 03/11 22:08
112F：→ a90648: internal control的定义就是他可以反映loading的蛋白量阿 03/12 02:20
113F：→ a90648: 在使用的internal control没问题的情形 03/12 02:21
114F：→ a90648: 定loading量和定internal control是一样的事情 03/12 02:22