作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
标题[求救] 摇菌抽plasmid (large insert)
时间Fri Mar 17 11:51:59 2017
各位大大好
想请教一个状况
我做5'RACE，用kit内附的in-fusion cloning kit塞了一个快8kb的insert进到pRACE vector内
vector本人约2.6 kb
之後transform到 Top10 competent cell然後涂盘、挑菌
2.5 ml LB+amp 摇overnight後限制酶切割有release出预期大小的片段
但plasmid 浓度很低，大概20-40 ng/ul吧 (picodrop感觉不太准)
会低於生技公司定序浓度的下限
於是我取35 ul的15% glycerol stock加入7.5 ml的LB+amp 在50 ml离心管中摇o/n
结果长超多，但污染了...因为抽出来浓度还是很低
想请问
对於这种large insert长很慢的状况
要收集到一定浓度的plasmid，放大volume去增菌的想法应该没错吧？
如此污染的状况会比较容易发生吗？
我在思考哪个程序污染的时候，想到glycerol好像没有无菌...
因为LB是新泡的，也是放凉後才加amp，自认应该没有问题
那想请问如果Glycerol要变无菌，常用的方法有哪些？
好像不建议autoclave，但过filter感觉会天荒地老...
想说有没有比较便捷的方式><
谢谢！
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1F：→ grox: 应该是混到杂菌 建议re-transform重新涂盘挑single colony 03/17 12:09
2F：→ grox: 再放大, 还有50% glycerol(glycerol+H2O)autoclave没问题 03/17 12:10
3F：→ kaofei: 楼上的意思是，不是因为我insert太大所以长比较差? 03/17 12:25
4F：→ kaofei: 因为我最初挑single colony的时候，只要是阳性的就长很慢 03/17 12:26
5F：→ kaofei: 喔我懂你的意思了XD~~谢谢 03/17 12:27
6F：→ kaofei: 但我想请问，如果是50% glycerol用来做stock要多少比例啊? 03/17 12:28
7F：→ a90648: 我是1:1加啦! final 25% 03/17 13:27
8F：→ a90648: 不过我是用含50% glycerol的LB 03/17 13:28
9F：→ kaofei: 可否再请问large insert转型的效率降低，是因为影响到菌 03/17 16:15
10F：→ kaofei: 的生长(菌量低)，还是因为她从high-copy变成low-copy? 03/17 16:15
11F：→ kaofei: 我一直以为是前者，因为摇菌(o/n)後总是相对清澈，但後者 03/17 16:16
12F：→ kaofei: 是否也有可能？如果是low-copy的plasmid，摇出来菌量多但 03/17 16:17
13F：→ kaofei: plasmid少是正常的吗？因为之後也有可能用BAC就好奇问问~ 03/17 16:19
14F：推 Ianthegood: 可能啊 是说冻菌final 10%应该就够了 03/17 18:16
15F：推 Ianthegood: 一般从stock拿菌建议抠抠涂盘 再挑single colony 你没 03/17 18:17
16F：→ Ianthegood: 有把stock解冻吧? 03/17 18:17
17F：→ kaofei: 有耶~但我当初冻了两管stock XD stock解冻不宜超过几次吗? 03/17 18:30
※ 编辑: kaofei (140.112.4.208), 03/17/2017 18:32:27
18F：→ Ianthegood: 一次都嫌太多... 03/17 22:28
19F：→ Ianthegood: copy number跟大小比较没关 跟plasmid的ori有关 03/17 22:52
20F：→ kaofei: 所以如果plasmid用完了，通常宁可拿plasmid重新转型?而非 03/18 08:58
21F：→ kaofei: 取Stock直接增菌吗？还是挑stock的菌不需要解冻?沾一下涂? 03/18 08:59
22F：→ blence: 还没定序,不知道要不要保存的plasmid,为什麽要冻stock? 03/18 09:37
23F：→ kaofei: 怕太晚冻会污染...想说Glycerol便宜..真定序错了在丢掉 03/18 09:42
24F：→ kaofei: 而且没做过这麽大的insert...怕错过任何阳性的colony XD" 03/18 09:45
25F：→ Ianthegood: 不用解冻 拿tip抠一点在plate上乱画就好 03/18 19:08
26F：→ tynse71864: 我都挖一点丢 LB摇 (掩面 03/18 22:39
27F：→ blence: 还在plasmid check阶段就每管mini冻菌不是更会污染出错吗 03/19 00:21
28F：→ kaofei: 好像没发生过这样的问题所以没有考虑过，只是俊放在4度C到 03/20 20:16
29F：→ kaofei: 到定序确认(一般要两天时间吧)不担心菌死掉或杂菌污染吗? 03/20 20:17
30F：→ a90648: 养的时候有加抗生素啦，另外菌没脆弱到放个两天就挂掉啦 03/20 21:35
31F：→ kaofei: 那那可以借问个问题吗？如果Toxic insert想要在RT长，摇菌 03/22 15:43
32F：→ kaofei: 一般12-16小时，若RT或30度会摇多久？中途会要补抗生素吗 03/22 15:45
33F：推 Ianthegood: amp比较麻烦因为他的resistance gene会吐到胞外, 所以 03/22 17:29
34F：→ Ianthegood: 我会建议starter culture如果养37要换medium再拉OD跟i 03/22 17:30
35F：→ Ianthegood: nduction. 低温一点还有其他的antibiotics应该没这个 03/22 17:30
36F：→ Ianthegood: 问题, 摇多久跟用多少iptg还请自己尝试XD 03/22 17:30
37F：→ blence: 上面好像回错了,应该是讲下一篇的 03/22 17:50