作者s992003 (Lord of Ethanol)
看板Biotech
标题[求救] 请问大肠杆菌表达蛋白问题
时间Fri Mar 17 12:06:48 2017
各位大大好，小弟最近进行大肠杆菌表达蛋白时出现了一个问题
实验流程是这样
沾取少量的菌加入10mL含有抗生素的LB
摇晃培养16小时後加入1L含有抗生素的LB
摇晃培养直到O.D值0.5~0.6之後加入1mM IPTG
表达4小时之後10000g离心收取菌
现在的问题在於:
离心收下来的菌异常的少，进而导致後续的纯化结果很差
但是实验流程明明有用UV测600nm波长的O.D值达到0.5~0.6之间
照理来说菌量应该取决於O.D值?
所以只要没测错就应该有正常的菌量才对
奇怪的是以前没有这个问题，是自从改成1L的LB加入抗生素之後发现有这个状况(以前没加)
此外UV测量器是公用器材，似乎设定有被动过
小弟想知道的是
1.加入IPTG之後细菌是否会继续生长
2.在大瓶1L的LB culture这边加入抗生素是否影响後续细菌的生长
3.UV仪器小弟不熟，有设定能够让测的O.D值变得跟原先不同?
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1F：→ milkpa: 请先知道何谓正常。另，加入IPTG诱导外源基因表现一般来说 03/17 12:40
2F：→ milkpa: 都会抑制host生长，所以前几次都会做一管平行实验，不加 03/17 12:41
3F：→ milkpa: IPTG的看生长曲线做比较 03/17 12:42
4F：→ a90648: 开到UV灯泡而不是可见光灯泡? 03/17 13:32
5F：→ Ianthegood: induce後还会不会长因素极多 host strain, vector, pr 03/17 18:20
6F：→ Ianthegood: otein size, toxicity等 03/17 18:20
7F：→ Ianthegood: "uv仪器"是全世界都长一样腻 03/17 18:21
8F：推 Ianthegood: 有可能是你的protein很毒 express的时候死光了 induce 03/17 18:22
9F：→ Ianthegood: 完再测吸光值看看 03/17 18:22
抱歉小弟仪器没有讲清楚，这次主要在於与先前成功实验的比较，所以不确定所谓正常的菌量该如何
我们实验室比较偏化学，这部分的实验没有在看生长曲线，都是直接试，跑胶看哪个条件好
然後小弟有比较IPTG对细菌生长的影响，没加IPTG细菌的OD值会比有加的高，表示有加的长比较不好?
小弟可能会再摇一个大量LB culture，来比较有无抗生素的影响
10F：→ blence: 从文章看起来就是只有抗生素与"UV仪器"是跟以前不一样吧 03/18 03:27
11F：→ blence: 既然如此,这次突然加抗生素的理由是? 03/18 03:28
老板一直认为之前实验条件得到的蛋白不够浓不够纯，一直想改条件
讨论後老板认为大LB culture应该要加才对，先前的实验是错的，理由如qumai大所说
其实蛮合理的，但是菌真的变很少，所以现在要厘清到底是本来菌就不该长那麽多还是别的问题
12F：推 tynse71864: 测的 OD值对吗@@ 03/18 22:37
有找其他比较熟练的人去研究仪器，测量步骤没错，只是好像没有甚麽标准品可以检查仪器本身是否正常
13F：推 qumai: 以前没加抗生素可能plasmid都被踢掉了,菌不用做蛋白长得快 03/19 13:21
要做蛋白，大大说得很合理，也许其实本来就不该有这麽多菌?
小弟准备要纯化长较少的菌跑胶看看
也许会比之前没抗生素长较多菌的时候结果还要好
14F：→ s992003: 为啥都会一直repeat Orz 03/20 12:20
15F：→ blence: 不浓,跟蛋白特性大小有关,要试的应该是诱导温度,时间,IPTG 03/20 13:00
16F：→ blence: 等；不纯,这一开始没问,也不知有没两端tag纯化或切胶处理 03/20 13:02
17F：→ blence: 而抗生素,反正养菌就该加,不用试有无的差异了 03/20 13:02
18F：→ blence: 另外,从10ml放大到1L续做4小时诱导再离心收菌,以早九晚五 03/20 13:06
19F：→ blence: 的工作时间,OD是有可能被高估,但这只是推测 03/20 13:07
诱导条件之前有抓过，应该还可以
抱歉我一直把问题放在菌量异常，没有提到後面的实验问题，我们是用his-tag搭配NTA beads纯化
另外我们是先把10mL放到1L放大，测OD是测1L那瓶的OD值，10mL的就是养16小时没有测OD
20F：→ Ice9: 一开始放到1L，是算OD值多少开始？养到OD 0.5–0.6 要多久？ 03/20 13:44
21F：→ Ice9: 对了，你10ml菌是养在什麽容器内？ 03/20 13:48
10mL养在细长圆底瓶，没有量OD，丢入1L里面养到0.5-0.6大约3小时
※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 03/22/2017 11:45:05
22F：推 star55555: 其实加抗生素菌体本来就会长得较差，而菌量少跟纯化效 03/26 11:29
23F：→ star55555: 果不好似乎没有关系 03/26 11:29