自问自答 我试了第二次後应该算成功了 第二次改变的条件有 1.cell lysate时加强sonication的能量 2.做gradient时确实vortex 让不同浓度确实均匀 gradient加完立刻超圆心 3.提高转速到4万rpm (之前依照说明书建议换算是3万rpm) 这次cell lyaste还是透明的 硬取最上层2ml来做WB 跑出来的结果两管lysosome fraction的LAMP1比total lysate 浓上许多 其他内容物比例也不同 但现在遇到的疑问是beta-actin 平常用beta-actin做control 这次也顺手染了beta-actin 结果total 和lysosome fraction出来是差不多的 查网路只知道cell fraction中beta-actin表现在cytoplasma, nucleus 比较少 查不到beta-actin在lysosome的比例 不知道有人能分享一下经验吗 谢谢 ※ 引述《hachibuya (黄金骑士 牙狼)》之铭言： : 我使用ThermoFisher的kit : Lysosome isolation kit from tissue and cultured cells : https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/89839 : 试着分离MDA-MB-231乳癌细胞的lysosome : 结果分离出来的东西做WB和total cell lysate有八七成像 : 表示分离完全失败 : 我遇到的一个问题是说明书上的范例使用A431 cell : lysate完是乳白色液体 超离心後会有很明显的分层 : http://i.imgur.com/NwQwo8H.jpg : 但是我的cell lysate是透明的 离完心全部都是透明的 : 我只好假装有分层取最上层2ml的液体来分析 : 结果是失败的 : 不知道有没有人有经验能帮帮我的 : 感激不尽 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 133.87.71.225 ※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1490596415.A.1CD.html ※ 编辑: hachibuya (133.87.71.225), 03/27/2017 14:34:00