作者reborn54391 (小邱)
看板Biotech
标题[求救] Western 问题
时间Fri Apr 7 23:42:20 2017
大家好 最近试跑western出了一些问题
如下
beta catenin 92kDa
https://imgur.com/a/u79tJ
GAPDH 37kDa
https://imgur.com/a/Cfqd8
LC3 16kDa
https://imgur.com/a/Ryiqp
同一片胶
beta catenin 和 LC3 呈锯齿状
GAPDH 虽然没有锯齿 不过却连在一起
不知道哪里出了问题?
条件:
12% gel 0.75mm
sample loading量10~15ul
running 160V 10min 接着90V跑到底
transfer to PVDF 湿式 240mA 120min
麻烦大家了
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1F：→ xxtomnyxx: 第一次看到 stacking 跑的电压比 separating 还高的！ 04/08 00:31
2F：→ xxtomnyxx: 你的 gel 应该是自己做的有分上下层的那种吧？ 04/08 00:33
3F：→ lail: 电流不稳?另外考虑蛋白质放少一点吗?(你放多少 质量 的蛋白 04/08 01:05
4F：→ lail: 质，拜托不要跟我讲体积) 04/08 01:05
5F：→ Ianthegood: 我也觉得是stacking跑太快而已 04/08 05:50
6F：→ roy047: 先慢後快 一开始60V而非160V才对 04/08 12:02
7F：→ reborn54391: gel是自己做的没错 蛋白量35ug 160V是参照前人的 04/08 18:08
8F：→ reborn54391: protocol 下次跑看看低电压 04/08 18:09
9F：→ reborn54391: 感谢大家解答 04/08 18:12
10F：→ xxtomnyxx: 知道 Western gel 分两层的原理的话，看到这电压一定会 04/08 18:59
11F：→ xxtomnyxx: 觉得有鬼。台湾科学研究的基础教育已死.... 04/08 18:59
12F：推 BGG: 要不要先了解原理，不是前人说的就是对的! 04/08 19:14
13F：推 cyc5566: 大推160V XDDDDDDDDDDDDDD 04/08 19:52
14F：推 tynse71864: 我有开160结果没事耶 (掩面 04/08 23:13
15F：推 aaaazzzz: 哈哈,我也用过400V跑15min,惊觉这两片胶比另外两片胶快 04/08 23:17
16F：→ aaaazzzz: 赶快把速度调慢,不过那次效果还可接受(但後来还是不敢用 04/08 23:18
17F：推 syusuke12: 我下次也要试试看160V 04/09 13:16
18F：推 osla30: 普通胶跟普通Buffer，开超过200过，会很烫且冒烟 04/09 15:44
19F：→ osla30: 要高电压要用特殊胶或特殊Buffer较没问题 04/09 15:45
20F：推 taya1991: 一般是先慢後快+1 04/09 22:08
21F：推 taya1991: transfer部分再小心一下，别转一般位移？ 04/09 22:10
22F：→ isu0911: 电压太高造成温度过高? 04/10 01:25
23F：→ QuTarh: 很危险 04/11 13:14
24F：推 smile07: 上胶电压太快 一般都先慢在快 transfer buffer有没有加me 04/16 01:33
25F：→ smile07: thanol 我忘记加过 跑出来好像也这样 04/16 01:33
26F：推 bob79620: 我之前就是依照前人的方法也跑出波浪型的wb 然後被老板 04/18 16:04
27F：→ bob79620: 骂到臭头 後来才发现前人的TEMED整整是别人的五倍 04/18 16:04
28F：→ bob79620: 改回原本倍数之後 就没跑过波浪胶了 04/18 16:05
29F：→ LIAR: 高电压的特殊配方式什麽啊？ 04/22 23:49
30F：→ xxtomnyxx: 厂商卖的 Bis-Tris-HCl gel 官方给 200V 50min， 04/23 01:57
31F：→ xxtomnyxx: 虽然也是可以买 Bis-tris 回来自己做，但 Bis-Tris 本 04/23 01:57
32F：→ xxtomnyxx: 身就很贵了......有钱人才能花钱换时间啊 04/23 01:58
33F：推 ko363630: 上胶我都用70跑。第一次看到160冲到底 04/28 21:05