作者blence ( )
看板Biotech
标题[闲聊] reporter assay从设计到完成需要多久？
时间Tue Apr 18 23:27:46 2017
纯粹闲聊
实验室难免会遇到一些实验需要与时间赛跑，
以reporter assay来说，
当老板的可能自星期一交代以下这项工作，
目的是探讨一段约500bp的promoter活性，
同时要一起比较若上面带有与疾病有关的单点突变，
活性又会有什麽变化
由於实验室必定没有coustruct，只能从订primer着手，
所以老板想看到初步data的话，
大概要给多少时间(自星期一起算)是合理的？
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1F：推 jabari: 老板急，半天都合理。 老板不急，三年也合理。 04/19 00:47
2F：推 jabari: 如果不是计画案的充要条件，就放宽心 然後忘记orz 04/19 00:49
3F：推 Bows: 顺利3周不顺半年 04/19 01:01
的确急，剩不到四周的时间就要出国给talk
不过没有概念，还以为这段时间内reporter看到差异时，是不是顺便补ChIP
当下问需要多久时没想太多，想说出国前生出来就好了
後来照时间序算一下也的确要三周才有结果
也就是cloning, site-direct mutagenesis, reporter常规流程各约需一周
看起来我应该没拖延
4F：→ lail: 要做的事情其实蛮杂的，而且PCR有可能不成功还要试条件等等 04/19 01:27
5F：→ lail: ，我觉得如果是新手老板可能要关心一下每个阶段的进度比较保 04/19 01:27
6F：→ lail: 险，熟手也很难说，因为通常同时会需要做其他事情，所以在 04/19 01:27
7F：→ lail: 不确定背景资料下很难有一个一定的标准 04/19 01:27
8F：→ huuban: reporter assay有多种吧，你预计怎进行? 04/19 16:30
是没有一个标准，所以一开始就先说只是闲聊阿
如果要认真的讨论就会涉及细节跟习惯了
以我们来说，一直以来都是用promega dual luciferase system
所以像这次reporter就会设计接到pGL3-basic/-promoter vector
再选个泛用的(Hela)跟主题相关的各一株细胞来测试结果
在台北地区的好处是订primer跟之後送订序都有厂商在一天内完成
所以我认为时间上的瓶颈应该是第一次PCR必需要有band
虽然最普遍的人类序列好像买clone省事
但基於期货运送的耗时与这些序列的特殊性
想三周内完成任务似乎是自己接最快
这次其实有六个不同chr片段需要尝试
随便算，想要全部失败的机率可能只有(0.5^6)=1.56%
幸好今晚刚看这六盘都长了colony了
期望这其中有几个在下周末就能测试reporter assay结果
9F：→ Sylvaine: 可以想想reporter assay从做construct到测定完需要做哪 04/19 16:43
10F：→ Sylvaine: 些事、目前有哪些可以先做，然後定时跟老板报告你做到哪 04/19 16:45
11F：→ Sylvaine: 里吧~~ 04/19 16:45
※ 编辑: blence (180.218.151.4), 04/19/2017 22:34:14
12F：→ untilnow: 很顺的话应该是2-3个月 04/19 23:02
13F：→ untilnow: 用PERT法估计 最有可能出现DATA的时间在2.8个月左右 04/19 23:04
14F：推 lail: 如果实验室不缺经费人力，就找四个人同时进行reporter，chip 04/20 06:12
15F：→ lail: ，dapa或emsa，只要有一个出来就足以当作preliminary data了 04/20 06:12
16F：→ lail: ，我们以前paper revise的时候为了跟时间竞赛都是全部的人下 04/20 06:12
17F：→ lail: 来分工 04/20 06:12
18F：→ lail: 其实reporter细胞也可能是实验瓶颈啊，以前也遇过试了3-5种 04/20 06:15
19F：→ lail: 相关细胞，但是有点的根本没反应，有点的反应不大，也花了 04/20 06:15
20F：→ lail: 不少时间 04/20 06:15
21F：推 gustpigex: 剩不到四周还要补ChIP..... 04/20 11:41
22F：推 ararthur: 即使是b大 不过reporter assay四周能完成吗... 好想知道 05/11 14:52
前面提到共有6组wildtype/mutant片段，到今天算第4周
2周内，其中3组接好wt/mt clone并各别测试一次reporter
3周内，共5组接好wt/mt clone，但只有4组来得及比较reporter
4周内，让这5组都至少进行过一次reporter或repeat
很可惜第3周结束仍有1组连wt片段的clone一直失败
怀疑是整个genome不只一套同源序列，可能要重新设计primer配对
考量时间因素後这周就放弃了，反正已有5组可以交差
※ 编辑: blence (180.218.151.4), 05/11/2017 21:23:11