作者k60351p (misakilin)
看板Biotech
标题[求救] WB strip strip可信度
时间Thu Apr 27 21:50:11 2017
想问一下版上的前辈们
我最近在跑WB
想看某个KINASE的磷酸化
依照别人的建议是先压PHOSPHO
再压TOTAL
但第一次结果出来磷酸化的确有改变趋势
但是TOTAL的部分也有改变的现象
不确定是否是strip所造成的误差还是什麽?
（internal control没问题，抗体是abcam，commercial stripping buffer）
想问phospho跟total在同一个位子
用strip压是否有可信度的问题?
（sample量有点多，如果都要跑二重覆会有加不完的班。。。）
另外想问，如果压出来的band偏淡，而且背景较深，是应该调二抗还是一抗的比例?还是应该调整blocking的方式
（5%skim milk blocking ,santa cruz 的抗体（非磷酸化），一抗 1:500 二抗1:5000）
麻烦大家给我一点意见，谢谢
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1F：→ Bows: totel 也是有改变的可能，背景可以用 2~5% BSA 做blocking 04/27 22:55
好喔～下次换blocking方法看看，但是好怕被骂烧钱QQ
2F：推 milkpa: 有影响，有遇过磷酸化跟一般抗体会竞争的，所以後来直接 04/28 00:29
3F：→ milkpa: 跑两片以internal control做比较。（遇过reviewer要求 04/28 00:30
4F：→ milkpa: 「所有」WB三重复的，实验室总动员做到死.....） 04/28 00:31
希望我毕业前不用投稿or遇到凶猛的reviewer ....
※ 编辑: k60351p (114.42.70.234), 05/01/2017 23:01:50
※ 编辑: k60351p (114.42.70.234), 05/01/2017 23:02:42
5F：推 ararthur: Phospho protein 建议用BSA blocking 所以total protein 05/11 14:44
6F：→ ararthur: 也必须用BSA blocking 我觉得是blocking buf的问题 05/11 14:45
7F：→ ararthur: 另外 total protein 本来就可能会变化 特别是随着磷酸化 05/11 14:46
8F：→ ararthur: 的比例变化 因为该treatment大概就是需要这蛋白活性 量 05/11 14:47
9F：→ ararthur: 也通常跟活性成正比 05/11 14:47