作者s992003 (Lord of Ethanol)
看板Biotech
标题[求救] 大肠杆菌表达问题
时间Mon May 1 18:11:02 2017
哈罗各位大大
小弟在做重组蛋白的表达
最近因为业务的推荐
把表达的菌株从原先的BL21换成C43（DE3) plyss
第一步送vector到菌里面涂盘没问题
第二步要从盘上筛选较强的菌这边有些疑问
学长姐传下来的做法是挑几个较大的菌株
都把他们摇16小时然後破菌
不用离心分掉膜跟细胞质 直接western看表现量
选Band深的就对了
请问这样的做法是正确的吗？
上网查有听说要测什麽copy number但不知道要怎麽测量
另外想问要怎麽确认我的蛋白产生inclusion body
这个蛋白是周边膜蛋白，但paper推测的穿膜区域已经把他切掉了
之前用BL21表达
测试好几种detergent 还有不同浓度的条件
都没办法溶出很多蛋白
也没有能做活性测试的材料
所以不知道有没有产生inclusion body
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1F：推 mosu0714: copy number从你用的plasmid去追查就知道了吧 05/01 20:40
原来copy number完全是跟基因有关 跟後面的事情无关!?
会不会我这个蛋白试了各种条件都没起色就是因为用了滥vector QQ
2F：→ milkpa: TM拿掉应该就是有机会soluble了吧，为啥还用C43？ 05/01 21:00
我们本来都这样子想，但跑胶结果看起来还是一堆卡在膜上的样子，不知道如何是好
※ 编辑: s992003 (123.205.17.239), 05/01/2017 21:46:07
3F：→ Ianthegood: copy number跟plasmid的ori有关 05/02 01:07
4F：→ Ianthegood: 你要做活性还要收inclusion body? refolding比掷杯还 05/02 01:08
5F：→ Ianthegood: 难啊 05/02 01:08
6F：→ icheee: 听起来是本来想要透过测活性来看有没有 inclusion body 05/02 05:35
7F：→ icheee: 但是没有测活性的 assay 所以想要用其他方式判断是否产生 05/02 05:36
8F：→ icheee: inclusion body? 05/02 05:36
我不想要inclusion body，但是不知道有没有发生inclusion body
i大没错，我的想法是听说inclusion body的蛋白通常不会具有活性，想看活性来判断
现在跑胶来看感觉蛋白卡死在膜上，用detergent溶出的效果极差，但不确定是否产生inclusion body
我以为C43 plyss会有比较好的结果，比BL21贵两倍说QQ
※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 05/02/2017 09:09:23
9F：推 icheee: 测表达条件我会离心分 supernatant 跟 pellet 然後跑胶看 05/02 13:44
10F：→ icheee: 看 induction 有没有成功 并看是不是 soluble 05/02 13:46
11F：→ icheee: （不过很久没表达/纯化蛋白了，有错请大家指正>< ） 05/02 13:47
12F：→ Ianthegood: 如果有闲钱的话 买一点bugbuster 看soluble/ib非常方 05/02 20:18
13F：→ Ianthegood: 便 而且small scale可以用很久 05/02 20:18