作者migu0531 (migu0531)
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标题[求救] 蛋白纯化解冻後出现沉淀
时间Mon May 1 22:14:25 2017
最近遇到蛋白的问题……做了好多批都这样
蛋白是用昆虫细胞表现的，经过I-per破细胞（有加PMSF）、离心後，用Ni -column纯化
elute buffer= 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole, pH8.0
蛋白纯化完放4度 2、3天没有看到沉淀。原本是想说测完蛋白浓度後，再加甘油放-20度
保存。但遇到六日又怕蛋白降解，所以直接放-20度
礼拜一冰上解冻後，出现白色沉淀，用Bio rad protein dye测蛋白浓度可以看到蓝色颗
粒物（应该是我的蛋白……）
请问改怎麽办？（之前别的蛋白有做过浓缩与PBS置换，直接冻-20就没这样。)
为什麽会沉淀？後续要做elisa 筛血清，沉淀物应该不能用
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1F：推 rasaze: 多试几种不同的buff啊...... 05/01 22:21
2F：→ migu0531: 前一个elution buffer是用20mM sodium phosphate, 0.5M 05/01 22:31
3F：→ migu0531: NaCl, 500mM imidazole,pH 7.4 ，也是会沉淀 05/01 22:31
4F：推 oceanl: 沈淀物经过vortex後会溶解吗？之前遇过会再溶回去的 05/01 22:34
5F：→ migu0531: 沉淀物用PBS溶不了……我的蛋白啊啊 05/01 22:37
6F：推 oceanl: 那你只好纯化完马上置换buffer了...(默） 05/01 22:43
7F：推 s992003: 是不是有些蛋白不适合冷冻，我有买过蛋白然後建议不要冷 05/01 22:46
8F：→ s992003: 冻的，比冷藏还容易坏 05/01 22:46
9F：→ migu0531: 蛋白不建议冷冻我就不清楚了！ 只知道不建议反覆冻溶。 05/01 23:09
10F：→ migu0531: 蛋白真是条不归路…… 05/01 23:09
11F：推 Invec: 高浓度imidazole最好不要冷冻，立刻置换buffer比较理想 05/02 00:21
12F：→ Ianthegood: 做protein就不要期待周末可以放假了... 05/02 01:56
13F：→ Ianthegood: column elute下来就透析吧 05/02 01:57
14F：推 icheee: 推 Invec 高 imidazole 不要冻... 而且一般冻会作 flash 05/02 05:15
15F：→ icheee: freezing 吧? 你说直接放 -20C 有经过 flash freezing 吗? 05/02 05:16
16F：→ migu0531: Flash freezing?应该没有……蛋白就直接从4度丢到-20， 05/02 07:17
17F：→ migu0531: 什麽也没做也没加东西 05/02 07:17
18F：→ migu0531: 想问问大家，都用什麽方法置换buffer? 目前我有用过amic 05/02 07:21
19F：→ migu0531: on离心加buffer顺便浓缩。还有AKTA的desalting column， 05/02 07:21
20F：→ migu0531: 但蛋白就被大量稀释，连western都认不到，根本不知道再 05/02 07:21
21F：→ migu0531: 哪个fraction出来…… 05/02 07:21
22F：推 icheee: Amicon/dialysis/ultrafiltration/desalting column 05/02 07:36
23F：→ icheee: Akta desalting column 连 280 吸收都看不到吗？之前也有 05/02 07:37
24F：→ icheee: 用过 pd-10 这种 open column 还算省事 05/02 07:38
25F：→ migu0531: 有一个很小很小的peak，但跑胶跟western一片空白 05/02 08:24
26F：推 rasaze: 那应该是你的protein沉淀卡在column里面了... 05/02 09:18
27F：→ rasaze: desalting column了不起稀释浓度2-5倍而已 WB不会看不到 05/02 09:19
28F：推 icheee: 是第一次纯化的蛋白？目标 buffer 是有文献参考或继承别人 05/02 13:29
29F：→ icheee: 的 protocol? 05/02 13:30
30F：推 icheee: 全新 protein 可能 buffer condition 要多试试 (这是在假 05/02 13:34
31F：→ icheee: 设你表达的条件/nickel column 纯化条件都没问题的状况下) 05/02 13:35
32F：推 icheee: 另外关於温度, 确实有些蛋白在室温可能还比4度/-20度稳定 05/02 13:37
33F：→ icheee: 这就要自己试; 回到冻的方式, 一般我是都丢液氮 flash 05/02 13:38
34F：→ icheee: freezing, 避免 cold denaturation 05/02 13:39
35F：→ icheee: 然後存 -80 05/02 13:39
36F：→ migu0531: 接别人的蛋白，但留下的资料不多，只知道之前的人是用ak 05/02 20:30
37F：→ migu0531: ta pure纯化，我也照做，但还是沉淀。 05/02 20:30
38F：→ migu0531: 另外很奇怪的事,我有配一瓶10倍的binding buffer 放4度 05/02 20:38
39F：→ migu0531: 几天就出现片状的结晶沉淀…… 不知道使用的二次水有无 05/02 20:38
40F：→ migu0531: 问题? 05/02 20:38
41F：→ icheee: 10x buffer 低温可能盐析出而已 05/02 22:14
42F：推 MujiCat: 低温乾燥离心机可以浓缩代换buffer的样本 ，但若有其他盐 05/05 08:48
43F：→ MujiCat: 类存在也会一起被浓缩 05/05 08:48