认真回 「定量」 ---------------- 一般「定量」的意思是把一个sample mixture里面的全部的蛋白或是 单一一种蛋白species的量给定出来。定total protein的量通常有几种方式， 最常用的有qubit还有好几个呈色法，包含bradford，BCA, lowry等。 qubit受欢迎的原因是因为你只要把东西混一混丢到机器里机器就会跟你讲你这里面 有多少protein。其他呈色法都需要你用已知浓度的standard去拉standard curve, 做出function後才能换算你的sample的浓度。根据你的吸光值测的波长我猜你用的 是bradford。你拉出standard curve後就可以算你的R^2，这个数字代表你的standard curve拉得多好多漂亮，你如果拉出R^2=1的曲线就可以到处跟人家说嘴说你的手超稳 standard多纯kit多好之类的。你的sample透过这个curve的function代入y之後就能 得到你的protein浓度->这才是你最重要的数字。 如果是真的用elisa定量的话也是类似的道理。elisa是透过免疫反应来定单一一个 protein species的量，理论上只有你的protein会被抓住, 其他的蛋白都会被洗掉， 最後再透过再一次抗体辨识後, 二抗上面的酵素一样可以作呈色反应，一样可以用 standard拉standard curve，一样有R^2, 一样要拿你sample的吸光值去fit你的 curve。最後会得到你的原本sample里面某个特定的protein的浓度。 western blot --------------- Western blot 也是透过免疫反应来定一个特定的protein的 浓度(其实只能说是半定量)。不同的是你的blot这时候同时还给了你关於这个 protein的大小的资讯。最常见的方式你的抗体上面会接HRP, 发出冷光, 在底片上 曝光，这个资讯最後转换成一条band的大小及粗细。理论上你也可以去用已知浓度 的该蛋白拉standard curve不过由於这种蛋白比较不好取得加上western blot先天 的因素, 一般只拿来看趋势而不拿来做精确的定量。通常会另外再压几个housekeeping gene当作control。 一般压western有几个先天的pre/assumption。你每个well的loading量一样。 这个意思就是你预期每个well里面放不同处理的同样数量的细胞/sample，所以你才 可以用同样的control来决定你现在要看的protein到底是比较多还是比较少。这个 背後又隐含了另一个asumption那就是不同的sample表现你的control gene的量 是差不多的, 具体化一点就是，不论代数，你的每颗细胞应该会有差不多量的actin 跟GAPDH。这个不成立的话你根本没有办法拿control来当作基准做比较。 透过定出protein的浓度来决定每个well要放多少sample这个动作叫做 standardization。非常重要。 然後是细胞代数。我没记错的话细胞每分裂一次叫做一代。所以代数越高细胞总数 理应会越多，还会以等比级数增加，这应该是逻辑上无懈可击的推理吧，怎麽从推文 感觉你很惊讶？ 我再帮你用我的assumption做一次总结，你取了不同数量颗细胞，收了protein， 做了bradford, 拉了很漂亮的standard curve, 没做quantitation/normalisation, 意思也就是你根本不知道你load到胶里面的到底是相当於多少颗细胞的total protein，然後你期望你压western blot的control会一样粗?? 以上所有的东西都可以在google跟维基百科上面找到。大概都有中文版的了。 学长姐没教你至少要自己做点功课。 ※ 引述《palo1930 (随欲而安)》之铭言： : 各位版友大家好，目前正在做NRK52E这株细胞做westen，在压actin确定定量时发现，随 : 着细胞代数越高，做出来的ben也越来越高...制作westen前有用elisa定量，定量结果皆 : 在0.995以上，想问有做这株细胞或是在做细胞westen的版友有没有发生类似的情况？ : P.S实验室4个人所制作的结果都一样，actin皆是最大代数的sample ben标高。 : P.SS把actin改成GAPDH结果也是一样。 -- 人好 欠表 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 131.111.5.162 ※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1493661338.A.D99.html