作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
标题[方法] DNA purification(~30kb)
时间Sun May 7 11:36:15 2017
大家好，前情提要如下：
我用T4 ligase黏了一段大概近30kb的dsDNA
之後要做in vitro transcription
理论上我应该要跑胶切胶纯化...= =
但这个步骤感觉会lose很多 (看到比较适合的是Zymo的，约50-70%大片段回收率)
所以我就只纯化接着往後做看看
所以我想问的是
我看qiagen blood & tissue他们elute最主要的就是约30kb的DNA
但第一次离心前我应该要有个DNA binding的动作
blood & tissue里没有
我想到的作法是：
1. ligation 200+ 加酒精 200跟buffer AL 200 离心然後之後AW1、AW2...
2. ligation 100+ mini里的PB binding buffer 500，离心，然後AW1、AW2...
3. Isopropanol沉淀法
但我不是很熟要怎麽调整盐类的浓度...有人可以指点我一下吗orz
不知道有没有人这样modify过或类似经验可以分享看看
谢谢>"<
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1F：→ Ianthegood: 你是黏完linear的直接做ivt? 不先clone起来? 05/07 18:42
2F：→ Ianthegood: isopropanol precipitation有盐没盐基本上没差反正你 05/07 18:45
3F：→ Ianthegood: 要调整到300mM NaOAc (或其他适合的盐) 05/07 18:45
4F：→ kaofei: 30kb要clone的话就要用pBAC了吧...但我家没有那种Vector 05/08 09:20
5F：→ kaofei: 所以只要加NaOAc就好~但又有没加没差是说没有也可以罗XD"? 05/08 09:21
6F：→ Ianthegood: 你里面原本有什麽盐没差 不加naoac你就等着离半天都 05/08 15:39
7F：→ Ianthegood: 离不出东西XD 05/08 15:39
8F：→ Ianthegood: 我是觉得想办法clone起来比较好 如果你下游出错你还要 05/08 15:41
9F：→ Ianthegood: 从ligation开始做 感觉很蠢 05/08 15:41
10F：→ silverberry: 同推先 clone 出来。30 kb 有 mutation 怎麽办? 05/08 18:49
11F：→ silverberry: 然後建议用 QIAEX II，最大可以抓到 50 kb。 05/08 18:50
12F：→ silverberry: 实战用过 55 kb 没问题。 05/08 18:51