作者REIDO (NEET)
看板Biotech
标题[讨论] protein保存在7M UREA还容易裂解吗？
时间Sat May 27 15:49:55 2017
我最近在分析ECM，先用guanidin萃取，因为要跑SDS-PAGE，所以还有透析
冻乾再用tris+UREA 7M回溶放-20°C。
因为跑胶发现趋势不太对，所以重新BCA定量，虽然每次3重复定量的准度很高，但
不同次定量却会有差异。
我的问题是，这个差距是怎麽造成的？
有猜过proteinase inhibitor作祟，因为从透析开始就没有inhibitor了。但
反过来说，ECM应该也不好切吧？每次trypsin过後盘子上还是一堆。
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最近你的吸引力将大幅上涨，周遭的异性将慢慢的被你迷惑，慢慢的开始爱上你......。
唯一美中不足的是───────那群异性中有一半以上是啮齿目，其余的则是爬虫类。
或是你也可以换个乐观的角度───爱上你的只有不到一半是爬虫类，其余都是啮齿目。
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1F：推 joseph103331: 重复解冻吗? 还是同一批分装? 05/27 17:51
2F：→ REIDO: 重复解冻 05/27 18:35
3F：→ joseph103331: 那有可能是重复解冻造成的蛋白质裂解,其实Urea放在 05/28 14:09
4F：→ joseph103331: 4度就很稳定了,蛋白质样本要放在-20或-80还是分装 05/28 14:09
5F：→ joseph103331: 比较安全 05/28 14:09
6F：→ joseph103331: Urea回溶的sample放一般冰箱能存多久我不知道,我有 05/28 14:10
7F：→ joseph103331: 一只样本放了半年跑胶看起来没甚麽差别 05/28 14:11
8F：→ REIDO: 请问为何重复解冻会伤害protein？ 05/30 15:37
9F：→ REIDO: 所以用UREA不需要担心protease的影响吗？ 05/30 15:37
10F：推 tynse71864: 结冻会使某些蛋白易断裂 (？)而失活 05/31 00:20
11F：→ joseph103331: 用guanidine萃的时候不加inhibitor应该也没关系 05/31 01:35
12F：→ joseph103331: 蛋白质在urea或guanidine的状态都是denature的 05/31 01:35
13F：→ joseph103331: protease会直接失活,所以不会有太大影响 05/31 01:36
14F：→ joseph103331: denature时重复解冻的降解就是键结断裂,详细不明XD 05/31 01:39
15F：推 july81212: 冻乾後保存要用时在回溶比较好吧 在liquid 内冻时氢键 06/01 20:25
16F：→ july81212: 有时会破坏蛋白 06/01 20:25
17F：→ REIDO: 了解！不过透析成纯水要冻乾这一段，不晓得protease会不会 06/05 10:17
18F：→ REIDO: 作怪。但又不可能把整个烧杯灌满inhibitor.... 06/05 10:18
19F：→ kingbar: 有确认过BCA kit能够compatible的urea浓度吗？ 06/05 22:45
20F：→ REIDO: BCA写3M，坦白说我不晓得3M是5X稀释前还是稀释後... 06/06 09:30
21F：推 tynse71864: 记得是稀释後； 透析体积多大啊 06/07 18:16
22F：→ tynse71864: 是说我老板不太建议抽乾冻蛋白，会有抽乾不易回溶或 d 06/07 18:22
23F：→ tynse71864: egrade问题； 有考虑收细胞时，直接分装好几管相同浓 06/07 18:22
24F：→ tynse71864: 度的，用一次就丢？ 06/07 18:22
25F：推 tynse71864: 没看到 guandine抽…请省略抽乾那段 Xd 06/07 18:34