作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
标题[求救] re-ligation的问题
时间Mon May 29 17:46:33 2017
大家好
就是，如果我有很多个dna片段，用限制酶有specific的overhang後
分组用T4 ligase作用overnight後，纯化再接出全长
ex: ABCDEF个fragments，AB CD EF各自接好後，再AB+CD+EF接
想请问
在第二次ligation时会需要注意甚麽吗？
当初限制酶切出了overhang会有可能再第一轮接完cleanup的过程中掉掉吗？
第一轮的T4 ligase会需要inactivation吗？如果没有会影响religation的效率吗？
欧然後想顺便请问有人遇过接出大片段的DNA(~30kb)後跑胶与Marker不符的情形吗？
我看paper有些人indicate的产物(明明应该比marker大)跑胶後却比marker低
因为我自己也遇到了类似的情形，我的产物(~30kb)怎样都比marker 25 kb的band低
就不知道是真没接到某个片段(那次实验室六个片段pool一起接的)
还是这是有可能的orz...
谢谢大家帮忙解惑
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1F：→ xxtomnyxx: 最後产物是环状的还是线性的？ 05/29 20:43
2F：→ kaofei: 是Linear，但这就有个问题是会不会头尾ligate变环形...当 05/29 23:40
3F：→ kaofei: 初设计primer时没想到orz 觉得会是个隐忧 05/29 23:41
4F：→ kaofei: 头尾是blunt end 05/29 23:42
5F：→ Ianthegood: blunt超难 想接都接不起来 05/30 00:34
6F：→ blence: (我的经验)几乎所有ligation protocol都建议RE切完做gel 05/30 00:44
7F：→ blence: elute或cleanup来移除不要的片段,所以overhang不至於掉掉 05/30 00:44
8F：→ blence: 这样,第一次的ligase也没有inactivation的问题 05/30 00:46
9F：→ blence: primer一般合成的时候5'没加P,PCR後头尾还是黏不起来,不过 05/30 00:50
10F：→ blence: 如果blunt end是切出来的,AE应该可以形成环形了 05/30 00:52
11F：→ icheee: 同上 blence 大大 overhang 在 per cleanup 应该稳定 而因 05/30 17:39
12F：→ icheee: 为已经有 cleanup 所以不需要事先 inactivate ligase 05/30 17:40
13F：→ kaofei: 嗯嗯，谢谢大大们的回答。所以如果都是PCR产物，头尾Blunt 05/30 20:52
14F：→ kaofei: end接的机率不高，两次ligation中间也不需要inactivation 05/30 20:53
15F：→ kaofei: 我是都有cleanup。会担心头尾接是因为我之前cloning都是 05/30 20:55
16F：→ kaofei: 都用pJET2.1，是blunt-end ligation..但可能kit还是不一样 05/30 20:56
17F：→ blence: 状况不同,pJET blunt-end有P,PCR product可直接接进去 05/30 21:31
18F：→ blence: 但你的A,E如果是PCR形成的blunt-end,两端都没P阿 05/30 21:37
19F：推 joseph103331: 如果site都不一样的话,就用RE切切看产物就知道有没 05/31 01:23
20F：→ joseph103331: 有形成环形了,也有可能只是跑胶误差啦 05/31 01:27
21F：→ kaofei: 好的！谢谢大大们热心解惑Q__Q！有Biotech版真好 05/31 09:58
22F：→ xxtomnyxx: 对了，溶DNA的buffer如果和marker的buffer差太多，也会 05/31 16:01
23F：→ xxtomnyxx: 影响DNA跑的位置 05/31 16:01
24F：→ Ianthegood: 看你是用什麽buffer system跑啦 tae其实对buffer salt 05/31 18:34
25F：→ Ianthegood: 的tolerance极高... 05/31 18:34
26F：→ kaofei: 我们家都用TBE耶，会对盐类比较不耐吗？ 05/31 21:57
27F：推 Ianthegood: 如果是la或lb这种次世代的就会比较敏感 tae tbe都满耐 06/01 04:39
28F：→ Ianthegood: 的 06/01 04:39