作者s992003 (Lord of Ethanol)
看板Biotech
标题[求救] 硷性环境的His-tag纯化
时间Wed Jun 7 17:17:41 2017
小鲁又来了，谢谢先前大大们的意见
之前一直在尝试用e.coli表达纯化
後来发现不论怎麽用 蛋白几乎全部都卡在固体中
老板认为应该是inclusion body
改用低温表达结果帮助不大
最後决定纯化inclusion body的蛋白
参考paper的方式用轻微变性的方式溶解固体
首先用含有lysozyme、PMSF的buffer收菌pellet
利用冷冻解冻再sonication破菌
10000g离心後再分别用1%、2%triton洗掉脂质膜
接着用1M NaCL清洗、再用DDW 清洗
这个时候的pellet其实没什麽变化，感觉没有洗掉inclusion body以外的东西
但还是继续做
用2M urea pH 12.5的 buffer摇晃8小时 溶解固体
16000g 离心30分钟，这时候的固体变很少了，已经溶解大部分
（这部分跑胶过了，有蛮多我的目标蛋白，还算乾净，背景没有很多杂band)
取上清液与NTA-beads binding 2小时
後面就用10、20mM 的imidazole清洗
然後用250mM imidazole elute
发现好像beads上吸的蛋白没有很多
可是照吸附原理来看
应该是pH越高 histag越容易吸上beads
但结果看起来不像
Beads说明书是说pH大於12的话binding不要超过2小时，怕beads被破坏之类的？
另外除了binding不好之外
Elute的效率也没有很好
还是说250mM的浓度其实不够
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 175.96.97.50
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1496827063.A.1AC.html
1F：→ VVade: 这哪个实验室设计的实验... 06/07 17:42
2F：→ s992003: 我们在清洗inclusion body比较粗糙 因为药品都还没来 但2 06/07 20:07
3F：→ s992003: M urea pH12.5是paper 的条件 06/07 20:07
4F：→ Ianthegood: ib里面应该不会有太多你的蛋白以外的东西 你就收ib就 06/07 21:29
5F：→ Ianthegood: 好 不用再过column了啦 06/07 21:29
好的我们後来发现真的不需要过column了，ib洗乾净的话真的都是我们要的蛋白
6F：推 huangsw: 要看你的蛋白用途阿, 另外pH太高, 很多resin撑不久 06/07 23:44
我们希望蛋白仍保有活性，後来有paper说ib不见得一定是无序纠结，我们才尝试走这条路
7F：推 joseph103331: Binding不好是怎麽看的? Wash有一起检查吗? 06/08 14:56
跑胶看binding前後的上清液 发现目标蛋白看起来没减少，但beads理论上的吸附容量蛮大的
感觉binding後的液体目标蛋白应该要明显减少?
※ 编辑: s992003 (140.128.123.73), 06/13/2017 17:11:29
8F：→ bloodgas: IB里的蛋白已经很纯了不用再nickle纯化了，主要是复性 07/07 12:29
9F：→ bloodgas: 之後有没有正确摺叠 07/07 12:29