作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
标题[求救] phenol-chloroform的贮存时间...
时间Sun Jul 23 22:53:26 2017
我因为某些原因需用传统法纯化ligation完的DNA
再买新的试剂前发现实验室有放很久很久(可能超过五年吧= =)
的phenol-chloroform isoamyl alchohol (25:24:1)
一直冰在四度c，棕色瓶，颜色还是纯净透明的 (有可能还没开过)
听说这个试剂的萃取效率会逐渐变差
我看大部分的有效日期顶多到一年
想请问这样还可以用吗= =?
今天有拿plasmid试着抽，方法大致如下 (有可以加强的麻烦指点>"<)
100 ul DNA与试剂等体积混合均匀後
13000 rpm, RT离5分钟後取水层 (没有repeat)
直接进酒精沉淀
先加0.5倍体积的 7.5M ammonium acetate然後加2.5倍体积的100%酒精
-80三小时
然後15000 rpm, 4度c 30分钟
之後用预冷的70%酒精wash两次 (只有第一次有看到pellet)
air dry，用PCR grade water回溶
测得浓度只有原先的0.4倍，260/280只有1.5多...
我之後纯化完的DNA要用做ivt的template
之前都用column纯化，但好像量会比较少，也没法去除endogenous RNase
所以就被建议用传统法抽，但目前实验室没人有经验
所以想请问版上大大相关的问题，以及操作上要注意的地方
还请不吝回答orz谢谢
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※ 编辑: kaofei (101.0.152.172), 07/23/2017 22:53:47
※ 编辑: kaofei (101.0.152.172), 07/23/2017 22:54:19
1F：推 tynse71864: 没印象要加 ammonium acetate耶 07/24 01:05
2F：→ Ianthegood: 要加阿 我学的protocol是加1/10体积的5M amonium acet 07/24 01:08
3F：→ Ianthegood: ate 不过多加好像也没差 07/24 01:08
4F：→ Ianthegood: wash离久一点呗 07/24 01:08
5F：推 tynse71864: 我直接加纯酒精-20度，1h就离心了 07/24 01:15
6F：→ kaofei: 也有人加3M sodium acetate但我不晓得跟Ammino有甚麽差 07/24 08:49
7F：→ kaofei: 所以，PCI放这麽酒还是可以用的吗？是否没变红就是没氧化 07/24 08:50
8F：推 tynse71864: 试过 Na acetate; 用途跟 ammonium acetate应该都是增 07/24 13:07
9F：→ tynse71864: 加离子浓度，让 dna更易被EtOH沉淀下来 07/24 13:07
10F：推 tynse71864: 我家的 PCI是放了快3年囧 但还能抽的出来 07/24 13:20
11F：推 joseph103331: 不够纯的话PC可以萃两次罗 07/24 16:52