作者xy234786 (阿亮)
看板Biotech
标题[求救] commasie 染色後的蛋白lysate没有band
时间Thu Jul 27 23:34:21 2017
请问各位，小弟收取10^7的阴道鞭毛虫，使用lysis buffer(4%CHAPS,8M urea)後，离心
取上清液测蛋白浓度有30mg/ml，之前以4倍稀释剂跑胶，染完commasie blue 後，得出的
结果竟是如图一样，完全没有banding，而是smear一条一条，这样是正常的吗？
http://i.imgur.com/Q5mxKYR.jpg
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1F：→ xy234786: 正常来说总蛋白lysate去跑应该要有一条条各种大小蛋白 07/27 23:37
2F：→ xy234786: 的band吧？ 我这样是因为没有破细胞破完全吗？ 07/27 23:37
3F：→ Ianthegood: 可以错的地方很多 细胞 lysis page coomassie 07/28 02:38
4F：→ Ianthegood: 每一步都要有control 07/28 02:39
5F：→ xy234786: 细胞指的是太少吗？ lysis buffer我是照着学长给的配 07/28 09:01
6F：→ xy234786: 需要sonicator打破吗？ 胶的部份应该没有问题 正常的配 07/28 09:01
7F：→ xy234786: 12%胶 染色我染10分钟後就多换几次清水... 07/28 09:01
8F：→ Ianthegood: "control" 07/28 17:57
9F：→ Ianthegood: 旁边跑一个新鲜的bsa就知道问题在哪一端 07/28 17:58
11F：→ xy234786: 我用我之前的纯化蛋白跑在旁边，这样代表什麽呢 07/29 10:59
12F：→ jsi: 看起来胶跟染剂没问题，靠近marker的sample隐约有淡淡的band 07/29 14:39
13F：→ jsi: 可能是蛋白质量少(细胞破裂程度不够，或细胞数量太少)，不过 07/29 14:41
14F：→ jsi: 有时候在WB，经由抗体抗原结合+放大效应，会有比较明显的band 07/29 14:42
15F：推 jsi: 可考虑用浓度较高的sample跑胶，若lysis buffer不会干扰跑胶 07/29 14:45
16F：→ jsi: 甚至可以不要加稀释液 07/29 14:46
17F：→ xy234786: 如果是破细胞破不完全，会测的到30mg/ml这样的浓度吗？ 07/29 19:31
18F：→ xy234786: 那如果这样是不是要用sonicator再破会毕较好 07/29 19:31
19F：→ jsi: 我不了解阴道鞭毛虫特性，无法判断您lyse cell过程是否足够， 07/29 22:38
20F：→ jsi: 加入lysis buffer後sonicate或其他增加蛋白质暴露的方法都值 07/29 22:40
21F：→ jsi: 得一试，要注意温度或其他条件，避免蛋白质遭受破坏。您用 07/29 22:41
22F：→ jsi: urea，需先确认是否会干扰蛋白质浓度测定试剂，是否有伪阳性 07/29 22:44
23F：→ jsi: 的问题存在? 07/29 22:44
24F：→ xy234786: 我是使用nanodrop测定，并以lysis buffer做为blank 07/30 10:30
25F：→ xy234786: 会不会是有可能蛋白都degrade了，断了，但仍然测的到高 07/30 10:31
26F：→ xy234786: 浓度 07/30 10:31
27F：推 joseph103331: 吸光值不太准 用Bradford定量看看 07/30 10:46
28F：→ xy234786: 我也使用braford试过了 确实有这样的浓度 07/30 13:43
29F：→ xy234786: 我使用sonicatorhttp://i.imgur.com/Rya8ioU.jpg後的跑 08/02 14:29
30F：→ xy234786: 胶结果 08/02 14:29
31F：→ xy234786: 这样算正常吗？ 08/02 14:29
32F：推 Ianthegood: 比较好一点罗 看来是本来你的虫的expression就比较平 08/02 16:23
33F：→ Ianthegood: 淡一点没什麽特别高的gene? 08/02 16:23