作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
标题Re: [求救] phenol-chloroform的贮存时间...
时间Mon Jul 31 16:46:59 2017
想来自己update一下使用心得顺便问问大家意见orz
我後来pheno-chloroform extract了三次才进到ethanol precipitation
第一个步骤是-20 overnight然後才去离心
airdry大概10分钟内，pellet从白色变得有点半透明我就加水elute。
测得浓度有点惊人
~700 ng/ul，但OD很可怕是3.78 260/280，peak大概260稍偏280一点
我们的机器无法看230。
呃...我还没往下做ivt，因为这麽高的OD从来没见过
查网路大部分讨论的是过低的情形，比较少论及OD太高代表的意义
有人说是RNA污染，但是我的Sample是PCR product或plasmid切割後ligate在一起的
所以这个可能性有点低
如果是phenol的污染会这样吗？
我是否需要再做一次纯化比较妥当？
谢谢！
※ 引述《kaofei (phoebe)》之铭言：
: 我因为某些原因需用传统法纯化ligation完的DNA
: 再买新的试剂前发现实验室有放很久很久(可能超过五年吧= =)
: 的phenol-chloroform isoamyl alchohol (25:24:1)
: 一直冰在四度c，棕色瓶，颜色还是纯净透明的 (有可能还没开过)
: 听说这个试剂的萃取效率会逐渐变差
: 我看大部分的有效日期顶多到一年
: 想请问这样还可以用吗= =?
: 今天有拿plasmid试着抽，方法大致如下 (有可以加强的麻烦指点>"<)
: 100 ul DNA与试剂等体积混合均匀後
: 13000 rpm, RT离5分钟後取水层 (没有repeat)
: 直接进酒精沉淀
: 先加0.5倍体积的 7.5M ammonium acetate然後加2.5倍体积的100%酒精
: -80三小时
: 然後15000 rpm, 4度c 30分钟
: 之後用预冷的70%酒精wash两次 (只有第一次有看到pellet)
: air dry，用PCR grade water回溶
: 测得浓度只有原先的0.4倍，260/280只有1.5多...
: 我之後纯化完的DNA要用做ivt的template
: 之前都用column纯化，但好像量会比较少，也没法去除endogenous RNase
: 所以就被建议用传统法抽，但目前实验室没人有经验
: 所以想请问版上大大相关的问题，以及操作上要注意的地方
: 还请不吝回答orz谢谢
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1F：→ blence: 260/280这麽高,大概断光了,跟直接测dNTP一样吧 07/31 17:29
2F：→ kaofei: 但我跑胶没有断光耶...不过Comb那边亮亮的让我觉得有点怪 07/31 18:08
3F：推 Ianthegood: pci後有过一两次chloroform吗? 把残余的aqueus phenol 07/31 21:39
4F：→ Ianthegood: 洗掉 07/31 21:39
5F：→ Ianthegood: ivt也没多贵 跑一个rxn下去就知道啦XD 07/31 21:40
6F：→ kaofei: 没有耶..因为看有的protocol没写想说也许不必要...orz 07/31 22:14
7F：→ kaofei: 我以为ivt挺贵的..可能我有加cap吧，平均一个rxt要7k多啊. 07/31 22:15
8F：推 joseph103331: 可能是没ligate的东西造成的? 08/01 00:08
9F：推 joseph103331: 需要乾净一点还是再用chloroform萃过一次较好 08/01 00:11
10F：→ xxtomnyxx: 我的经验上 P-C 酒精沉淀纯化的 DNA 260/280 都很容易 08/01 17:12
11F：→ xxtomnyxx: 异常高，原因不明，把产物再过一次 PCR-cleanup Kit 後 08/01 17:13
12F：→ xxtomnyxx: 260/280 就会正常 08/01 17:14
13F：→ Ianthegood: 喔哇呜你的kit好贵 真核的吗? 08/01 21:12
14F：→ kaofei: 是说表现系统吗? 啊我其实是要用来Rescue ssRNA病毒的... 08/03 21:12
15F：→ kaofei: 欸我算错了，是700多XDDDDDDDDDDDD" 阿好白痴 08/03 21:16
16F：推 yfw: DNA降解了 08/07 13:23
17F：推 yfw: 建议重抽 不要交谈 确定环境还有手套都是乾净的再抽 08/07 13:26