作者chan50515 (姆哈哈～)
看板Biotech
标题[求救] PCR产物大小错误，但质体构建成功
时间Tue Aug 22 20:14:51 2017
大家好，最近实验遇到一个问题
先简述实验内容：
1. PCR vector and insert
2. Digest with enzyme
3. Ligation
第一步骤PCR完大小是错误的
预期vector大小约为4.9k bp (原始质体大小5.9k bp)
但agarose gel结果显示却不是如此 (如附图)
http://imgur.com/9k2QSmi
但由於PCR结果十分专一，因此我还是回收後做酶切
大小一样比预期中的大 (如图)
http://imgur.com/5ODd62M
虽然大小未跟预期的相同
我仍然继续往下做vector and insert ligation
最後转化及验证结果
是以colony PCR insert及酶切2刀确认质体大小
皆为我要的质体 (构建成功)
想问问大家是否有遇过这种状况?
以下为我PCR的所设定的program
94C, 5 min
94C, 40 s ----
55C, 30 s |-30 cycles
72C, 3 min ----
72C, 10 min
第一次遇到这种状况
想请问有没有人知道原因？
谢谢!
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.116.168.31
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1503404096.A.AE8.html
※ 编辑: chan50515 (140.116.168.31), 08/22/2017 20:18:42
1F：推 Bows: vector 用PCR?没定序过什麽都是假的 08/22 21:38
2F：→ rasaze: 就像一楼说的定序完再来说成功 08/22 22:06
好的 谢谢!
3F：→ Ianthegood: polymerase跟胶系统都没讲啊 08/22 22:18
PCR是使用Ex-Taq
4F：→ Ianthegood: 你insert如果有做对 colony批跟切当然都会是对的size 08/22 22:20
5F：→ Ianthegood: 啊 08/22 22:20
6F：→ Ianthegood: 不止要定序 你还得把整个vector都定完 08/22 22:21
好的! 谢谢你的提醒
7F：→ blence: Vector要PCR大概是没RE切点,不过放30cycle太多,容易有突变 08/22 22:24
是的，因为vector与insert没有相同切点
所以皆须PCR
8F：→ blence: 假使没切位,使用验证方法有办法排除5.9k的污染吗？ 08/22 22:24
9F：→ blence: 至於产物偏高,使用safe-dye内染的操作是有可能出现的 08/22 22:26
10F：→ aj1139: 同以上各楼，先定序确认再做吧 08/22 22:26
好 了解了 谢谢各位
※ 编辑: chan50515 (140.116.168.31), 08/22/2017 22:40:35
11F：推 joseph103331: 原始大小5.9k 产物5.9k,是把原质体的insert一起做出 08/23 00:56
12F：→ joseph103331: 来啦? 08/23 00:56
13F：→ Ice9: 我个人其实不太建议原PO在非得使用这个 vector 的情况下这麽 08/24 01:23
14F：→ Ice9: 做。我的做法会是 vector 切一切，补平，insert 平塞。之後 08/24 01:25
15F：→ Ice9: 长出来的，再用 PCR 或 RE 先确定顺序，再送定序。 08/24 01:28
16F：→ Ice9: 如果 insert 也是切出来的，那更好了。先将 V/I 切切纯化， 08/24 01:29
17F：→ Ice9: 再设计引子把 V/I 连接後整个 PCR 出来，纯化、喂菌、定序。 08/24 01:31
18F：→ Ice9: 而後者的 PCR 酵表，建议用高规格的。此时通常只定序看切位 08/24 01:32
19F：→ Ice9: 唔，赶在被打脸之前改一下我的建议做法： 08/24 20:10
20F：→ Ice9: 先将 Insert PCR 出来纯化，引子用含有一部分 vertor 插入位 08/24 20:11
21F：→ Ice9: 附近的序列。然後以之前的insert为 primer 去对vertor做PCR 08/24 20:12
22F：→ blence: 上面提到的应该就是two-step site-directed mutagenesis 08/24 21:14
24F：→ blence: 文中提到可以1k,我自己<2k都没问题,但3k以上就没成功过 08/24 21:15
25F：→ blence: 原po的方法还是有遇到的机会,不过我比较偏好重新创造MCS 08/24 21:17
26F：→ Ice9: 我手上做过的 insert，确实没有超过 2K 过。 08/28 16:14
27F：推 boblu: 喜欢自己做 cloning site +1 09/07 04:56
28F：→ satasumi: 换一家MARKER对照看看 06/23 16:33