作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
标题[求救] 电转後细胞会aggregate
时间Tue Sep 5 11:16:10 2017
大家好：
想请问电转mammalian cell的问题。
我的细胞是vero，电转的核酸是~30k的RNA
protocol大致如下：
细胞会前一天继代到175T，实验当天约8-9分满
Trypsin 2ml下去後等约五分钟，细胞都变圆变亮後轻敲detach
medium回溶後4度离心，去除上清液
PBS wash两遍後细胞计数，并回溶到适当浓度 (1x10^7/ml)
将RNA加入细胞(0.8 ml)後加入0.4 cm的cuvette
参数是4 pulses at 450V, 50uF
细胞hood内recover 10 min，transfer到已回温complete growth medium
隔天观察细胞
我的问题是，电转完後我的PBS-cell suspension都会有很多泡泡，这是正常的
但细胞常常会aggregate在一起，变得跟鼻涕一样浓稠
然後似乎aggregate越多，代表细胞viability越差，会贴下去的细胞越少
但我不太确定这可能是哪个步骤所造成的。
是细胞本人(新解冻约第5代)？
Detachment过程 (trpsin下去後rinse几遍就会倒掉然後等细胞rounding)?
电转的buffer?
因为实验需求，贴下去的细胞之後还要再碰trypsin，所以要有一定的满度，不然就GG了
不知道有没有人有经验可以分享的，有那些小细节我可能没注意到造成细胞存活下降
还有要怎麽避免细胞Aggregate的问题
大感谢>"<
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.112.4.208
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※ 编辑: kaofei (140.112.4.208), 09/05/2017 11:17:05
※ 编辑: kaofei (140.112.4.208), 09/05/2017 11:18:23
1F：→ xxtomnyxx: 我猜是细胞死掉释放出 DNA 把细胞缠在一起造成的？ 09/05 11:18
2F：→ kaofei: 我有看到这个说法，也看到有人说可以加DNase来避免，但不 09/05 11:19
3F：→ kaofei: 知道是否真的可行XD" 或我有办法後处理把他们松开吗? 09/05 11:20
4F：推 joseph103331: 是不是吸到泡泡了？电转的时候我不会去吸那些，那 09/05 11:54
5F：→ joseph103331: 些是死细胞 09/05 11:54
6F：→ kaofei: 我就是用1000ul的tip能吸的都吸起来，但我没用medium 09/05 11:58
※ 编辑: kaofei (140.112.4.208), 09/05/2017 11:59:02
7F：→ kaofei: 去wash cuvette下次会记得...所以泡跑不要吸，鼻涕样物呢? 09/05 11:59
8F：推 joseph103331: 我会用200uL的tip先把结成团的泡泡移到壁上，再尽 09/05 16:46
9F：→ joseph103331: 量吸剩下的medium，这样做我没看过鼻涕样的东西， 09/05 16:46
10F：→ joseph103331: 但不免还是有一点细胞碎片就是。 09/05 16:46
11F：→ joseph103331: 我在想那些泡泡就是细胞纠缠在一起混合鼻涕的东西 09/05 16:48
12F：→ joseph103331: ，可以试试另外取出来用显微镜证实。 09/05 16:48
13F：→ Ianthegood: benzonase可以试看看 09/05 23:22