作者ernielwl (ernielwl)
看板Biotech
标题酵母菌的蛋白表现
时间Thu Sep 14 22:34:33 2017
表现真核生物的蛋白质的时候通常选用酵母菌
而非细菌是因为同样为真核生物可以做修饰
真核生物的基因一般都带有Intron
所以都是由mRNA转成cDNA来做表现
理论上mRNA用Oligo dT当作Primer做RT-PCR转成cDNA
但是我Boss说实际上mRNA在操作时候容易断掉，很难只用dT primer做成功
一般都用Random primer比较合理
然後要PCR做出全长2k以上的cDNA不容易
所以现在都改用直接拿序列给厂商合成DNA的方式去做了
那小弟想说，为什麽不直接拿gDNA去给酵母菌表现呢？
同为真核生物应该也有剪切Intron的功能吧？
但是Boss说都没有人这样做......
如果是因为物种差异造成intron splicing不同
那要做真菌的蛋白质表现成功率是否可能会比较高呢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 180.217.199.95
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※ 编辑: ernielwl (180.217.199.95), 09/14/2017 22:35:39
1F：→ blence: 如果可以拿gDNA给酵母菌表现的做法,那不就可以把total RNA09/14 22:52
2F：→ blence: 丢给酵母菌做了？09/14 22:52
如果只是针对某一段蛋白，cds 2kb而 gDNA含intron 5k左右
3F：→ blence: 如果说mRNA容易断掉,random hexamer也无法克服这个问题09/14 22:55
4F：→ blence: 我认为是接的clone太少,才会说2k以上的cds cDNA不容易09/14 22:58
我Boss说用dT primer就只能从尾巴往前P，如果中间断了就做不出来，Random就有机会做
出前面或中间的片段
所以拿cDNA做Template时候，primer设计夹出的片段一次大概1kb以下，太长会失败，要
做出2K以上的cds都要分3~4段起来组
※ 编辑: ernielwl (180.217.199.95), 09/14/2017 23:17:47
5F：推 joseph103331: 你可以试试看,不过这已经可以另成题目,有太多可能的09/15 00:02
6F：→ joseph103331: 问题弄在里面,你又不是要设计表现系统的人....09/15 00:02
7F：→ joseph103331: 而且多加一个splicing在表现过程中,天知道会多出来09/15 00:03
8F：→ joseph103331: 甚麽奇怪的东西09/15 00:04
我Boss有开玩笑说要我去表现gDNA，反正去抽酵母菌RNA比对gDNA就知道splicing的方式
对不对，有点苦笑不得XD
※ 编辑: ernielwl (180.217.199.95), 09/15/2017 00:25:54
9F：→ xxtomnyxx: 以现在的技术这根本不是问题，我用 dT20VN 做 RT，09/15 12:57
10F：→ xxtomnyxx: 5'-UTR 5 kb ORF 3.6 kb 的基因照 clone 不误。09/15 12:58
11F：→ xxtomnyxx: 不只是因为 splicing 的问题，真核生物一堆 intron 不09/15 13:01
12F：→ xxtomnyxx: 知道在大几点的，gene body 随便都破 10 kb，这麽大的 09/15 13:03
13F：→ xxtomnyxx: 序列要放到 vector 上只能用 BAC 或 YAC，但是操作这些09/15 13:03
14F：→ xxtomnyxx: vector 比操作 plasmid 麻烦的多。况且也没多少 polyme 09/15 13:04
15F：→ xxtomnyxx: rase 能够放大出超过 10 kb 的序列。 09/15 13:04
tomny大讲的都对，只是目前我lab要表现的蛋白其实挺短的，cds 2k ,gDNA 4k而已 所
以有点想尝试看看
※ 编辑: ernielwl (180.217.217.30), 09/15/2017 17:37:44
16F：→ blence: 你的前提是建立在该基因的gDNA只有一种transcript,如果你 09/15 20:50
17F：→ blence: 的是人类基因,可以去ensembl看有多少alternative splicing 09/15 20:50
18F：→ blence: 然後再去推敲该基因在酵母菌的剪接会不会比在人类还精确? 09/15 20:51
19F：推 Ianthegood: 当然有人这样做啊怎麽没有 如果又是fungus那表现成功 09/15 23:03
20F：→ Ianthegood: 机率就真的很高了 09/15 23:03
21F：→ Ice9: 不建议用人的intron去给酵母切，除非你确认过那序列在酵母没 09/16 04:13
22F：→ Ice9: 问题。另外，promoter序列有时会影响剪接效果。 09/16 04:14
23F：→ Ice9: 而且，酵母中的intron普遍远短於人类的长度，顶多上千nt.， 09/16 04:18
24F：→ Ice9: 所以很可能会造成意外。如无特别需求，还是别考虑用这种方式 09/16 04:19
25F：→ Ice9: 酵母-->酵母菌 09/16 04:20