作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
标题[闲聊] 如果Poly A tail没有以A作结
时间Mon Sep 18 21:01:07 2017
想请问
就如果以人为的方式转出mRNA，通常会在3'端帮他做个poly A tail
假使当初把gene clone进plasmid，但没有设计好限制酶切位
早成产物切下来後还会带有一段限制酶切位在poly A tail之後
如下方
T7-ATGXXXXXX.........TAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGTACC
这会影响到mRNA的功能吗？
谢谢~~
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1F：→ ernielwl: 才疏学浅.....第一次看到人工加poly a 09/18 21:10
2F：→ ernielwl: 如果要表现成protein，只要你的cds完整就可以了 09/18 21:11
3F：→ ernielwl: 转译做到stop codon就会停了不是吗 09/18 21:12
4F：→ kaofei: 用primer induce poly A不行吗@@？我看paper是这样弄得... 09/18 23:06
5F：→ kaofei: 我印象中poly A是用来保护mRNA的，但不确定会不会影响转译 09/18 23:10
6F：推 eric2853: 我也是第一次看到自己加polyA的... 09/19 00:38
7F：→ Ianthegood: 看你的mRNA想干嘛啊 09/19 02:26
8F：→ Ice9: 你看过plasmid map 吗？在MCS後面通常会有poly-A signal，不 09/19 07:58
9F：→ Ice9: 需要人工加上A尾。而且，你加上去，它也是被当作3'UTR一部分 09/19 08:00
10F：→ Ice9: 会黏上什麽东西，不知道。 09/19 08:00
11F：→ kaofei: 想用来做transient expression of the targed protein 09/19 09:06
12F：推 leptoneta: 这是好问题 可以研究看看 09/19 11:06
13F：推 qiet: 要不要先check你的plasmid有没有polyA阿 通常都有耶 09/19 11:38
14F：→ blence: 如果原po用T7来表现,是没有polyA的,我刚看pRSET,pET45就是 09/19 13:10
15F：→ blence: 就算是一般vector用的SV40 polyA,也不会是全都A 09/19 13:16
16F：→ a90648: 原PO的T7感觉是in vitro transcription时用的 09/19 13:46
17F：→ a90648: 接进去的plasmid不知道是哪个promoter 09/19 13:47
18F：→ a90648: 不过已经做过in vitro transcription了，从那个plasmid 09/19 13:48
19F：→ a90648: 切下来接到要用的expression plasmid就好啦 09/19 13:49
20F：推 Ianthegood: 他要ivt出rna再电进细胞啦 如果是这样我觉得那几个bas 09/19 20:13
21F：→ Ianthegood: e会有差 09/19 20:13
22F：→ Ice9: 抱歉，眼残没见到T7在前。 09/19 21:36
23F：→ kaofei: 想请问楼楼上会有差是因为甚麽呢? 3'UTR太长或序列错吗 >< 09/20 12:37
24F：推 Ianthegood: 我觉得电进去後的stability会很糟 09/20 15:03
25F：推 qiet: 同上没看到T7, 是我就会重做, 不希望有这种不确定因素 09/22 20:01
26F：→ qiet: 避免因此使後面troubleshooting疑神疑鬼的 09/22 20:02
27F：→ Ice9: 忽然想到，因为mRNA是裸露的，所以後面多几个其他bases可能 09/23 08:35
28F：→ Ice9: 没有差别，进去要不是做几个蛋白出来，就是马上被消灭。重点 09/23 08:36
29F：→ Ice9: 可能还是在RNA品质等其他因素上。另外，记得以前看过 poly-G 09/23 08:37
30F：→ Ice9: 在细菌有较长的half-life，但不知道在细胞株中是否也是。 09/23 08:38
31F：→ xxtomnyxx: 楼上，mRNA可不是裸露的阿.... polyA tail 就是让 PABP 09/24 04:25
32F：→ xxtomnyxx: 黏上去，以减缓 RNase 从 3' 端快速降解掉 mRNA 09/24 04:26
33F：→ Ice9: 它送进去就是裸的啊。送进细胞去，就看是PABP先靠上去还是 09/24 18:40
34F：→ Ice9: exonuclease先解决它。 09/24 18:41
35F：→ kaofei: 谢谢大家提供的意见XD 我看到paper上polyA後面会接的RE 09/24 22:16
36F：→ kaofei: 切位包括BamHI跟NotI，前者会留一个T，後者留GC，看来是可 09/24 22:16
37F：→ kaofei: 行的，但我自己的会多4个bp，所以就很好奇这影响会有多大 09/24 22:17