作者enjoyable264 (enjoy)
看板Biotech
标题[求救] Western Blot做出来的band会歪向一边
时间Wed Sep 20 17:51:07 2017
各位Western Blot 大大好
目前在做Sucrose gradient 跑超高速离心的实验
想了解细胞膜上蛋白在lipid raft上的位置
以下实验步骤参考论文所述
细胞收自100mm dish
加入850ul Sodium Carbonate刮下所有细胞也一并加入蛋白酶抑制剂了
将850ul混合90%Sucros再依续叠上不同浓度的Sucrose
上机离心overnight後共收了10个layer
各别加入Sample buffer 98度煮10分钟
接下来进入WB步骤
10% gel
Running condition: 80V 30min後再120V 100min
Transfer condition: 400mA 2hr(只剩marker上面一点点残留在胶上其他的都过去了)
Blocking: 3% skim milk 1hr
1st Ab: Santa Cruz Ab 1:100 overnight 4度
Wash 三次共60min
2nd Ab: HRP 1hr at RT
Wash
呈色用Thermo家出的Femto呈色
结果出现band往左移的现象，而且也不够Sharp
想请问各位高手是否有方法可以改善
重覆很多次都要崩溃了
附上图连结
https://imgur.com/Dj9w6p6
感谢大家
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1F：推 tynse71864: sucrose再加 sample bfr会非常稠; load胶前先vtx混匀 09/21 00:38
2F：→ tynse71864: 再 load，或是 sample用水稀释些可能可以解决 09/21 00:38
3F：推 tynse71864: 最左跟右是 Mr吗? 09/21 00:40
4F：→ enjoyable264: T大 是marker没错 09/21 09:17
5F：→ enjoyable264: Loading之前都有vortex过了，加水稀释我怕protein量 09/21 09:19
6F：→ enjoyable264: 太少 09/21 09:19
7F：推 joseph103331: 怕太少就多收点，不然就做透析或蛋白质沉淀 09/21 10:09
8F：推 cyc5566: 其实我觉得做这样够漂亮了 09/21 17:47
9F：推 tynse71864: 胶多厚呢 09/21 20:57
10F：→ enjoyable264: 1.5mm 09/22 15:08