作者ccjwo (靘~BI单身日记)
看板Biotech
标题[求救] PCR的band消失了
时间Mon Sep 25 13:38:06 2017
小弟正在利用PCR和Rsa I digestion的方式进行db/db mice的genotyping，
以下为primer与PCR条件
Rsa I-F (5’-AGAACGGACACTCTTTGAAGTCTC-3’)
Rsa I-R (5’-CATTCAAACCATAGTTTAGGTTTGTGT-3’).
94℃for 1 min,
55℃for 1 min,
72℃for 1 min for 40 cycles.
一开始两个月都没问题，但却突然在两个星期前开始P不出任何band了，
primer重订、polymerase重买，同样的PCR reaction在另一组lepr全长的primers做为con
trol
有p出正确的band但利用新订的Rsa I primer却p不出任何band，
想请问版大门是否有逾过相同的问题，或是有什麽提议能解决这个问题?
感谢大家。
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狠多东西需要证明的原因..
不是因为被相信..而是因为被怀疑..
如果你深信不疑..那又何必去证明呢??
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1F：→ turtle24: 旧的gDNA有试过吗？09/25 14:44
2F：→ turtle24: 抽gDNA的试剂同一批？09/25 14:46
3F：→ ccjwo: 有利用之前成功过的旧gDNA当contorl，Rsa l primer一样p不09/25 14:55
4F：→ ccjwo: 出来，Lepr全长的primer就p的出来，抽gDNA的kit是不同组但09/25 14:55
5F：→ ccjwo: 跑gel是有抽到gel上有band。09/25 14:55
※ 编辑: ccjwo (114.137.92.7), 09/25/2017 14:57:17
6F：推 joseph103331: 该不会机器出毛病吧…去其他家借一下机器，或是微09/25 15:26
7F：→ joseph103331: 调一下annealing的温度如何？09/25 15:26
8F：→ ccjwo: 同一台机器同一组条件,lepr有p成功但Rsa I 没有band,试过三09/25 17:39
9F：→ ccjwo: 种温度50...52...55...结果都一样...09/25 17:39
10F：推 HateRoach: Buffer有没有换过阿09/25 22:15
11F：→ ccjwo: 有...整个polymerase都买新的了...09/25 22:28
※ 编辑: ccjwo (114.137.92.7), 09/25/2017 23:39:43
12F：推 Ianthegood: 同样的polymerase? buffer跟dNTP有换吗 09/26 00:34
13F：→ ccjwo: 同样的polymerase所以用新的同牌buffer,我有用两种不同牌 09/26 17:33
14F：→ ccjwo: 的dNTP进行PCR,一样只有lepr primer control有成功, Rsa I 09/26 17:33
15F：→ ccjwo: primer一样没有band 09/26 17:33
16F：推 ernielwl: 哪家厂商做的primer.该不会做错了 09/27 00:33
17F：推 joseph103331: Rsa片段是lepr的其中一段吗？不然把p出来的lepr拿 09/27 03:02
18F：→ joseph103331: 去定序，再回来对Rsa primer看现在订的能不能黏上 09/27 03:02
19F：→ joseph103331: 去？ 09/27 03:02
20F：→ blence: 文中提到用lepr全长的primer,应该不是lepr基因全长吧? 09/27 22:11
21F：→ blence: 原po好像能换都换,也都有对照,或许不是PCR反应的问题? 09/27 22:16
22F：→ blence: 例如这类PCR-RFLP需要创造切位,往往产物小,影响跑胶观察 09/27 22:20
23F：→ ccjwo: 不是，我的意思是能够p出lepr全长的control primer...是用 09/28 10:32
24F：→ ccjwo: 来确定整个PCR reaction并没有问题...而Rsa l primer能p出 09/28 10:32
25F：→ ccjwo: 的长度为135 bp...在3% gel上可狠明显的看到...接着我们再 09/28 10:32
26F：→ ccjwo: 利用Rsa l进行digestion...wt会得到135 bp的band...+/-有三 09/28 10:32
27F：→ ccjwo: 个band...-/-有两个band... 09/28 10:32
28F：→ turtle24: PCR机器最近有没有做保养或检测，我有遇过温度不准的 09/28 23:56
29F：→ turtle24: 放正中间会p不出来的那种… 09/28 23:57
30F：推 joseph103331: 试剂都没有问题那就回到条件上面罗，从机器、温度 09/29 00:59
31F：→ joseph103331: 跟primer方面着手吧，重新设计primer是否可行？ 09/29 00:59
32F：推 csmceddie: 135bp 72度 1分钟太久了吧 09/29 01:50
33F：推 csmceddie: 我猜你的data应该不是完全没夹到东西 09/29 01:52
34F：→ csmceddie: 而是smear 所以看不到major band是吗？ 09/29 01:53