作者patricksky (江伯)
看板Biotech
标题[求救] 切胶纯化後DNA再次跑胶卡在well中
时间Thu Jan 18 16:41:55 2018
各位好,
最近发现PCR产物(200bp多)切胶後，再次跑胶发现产物不见了，
并且似乎卡在 gel well上，有smearing DNA痕迹
https://i.imgur.com/aFQ96yL.jpg
但是positvie control DNA 同样切胶纯化後，DNA产物再次跑胶是没问题。
实验做了三次，後两次纯化步骤有换新buffer，但是三次产物切胶後都不见了，
产物似乎都卡在gel well里面，但是positvie control三次实验同样没问题。
检体PCR产物量比control少，产物亮度介於100和500bp亮度中间，不算多也不算少，
同时检体有很多其他bands，control是一条band
检体是病人血液 DNA，positive control是健康人血液 DNA
因为positive control没问题，所以我认为PCR和切胶纯化步骤本身没有问题，
是否是检体本身造成的影响?
以下是其他资讯
1. 使用Bioman EasyPure PCR Clean up/Gel extraction Kit
2. 因有人共用此产品，buffer 会分管使用，有换过新分管buffer
3. 依据使用说明书，纯化步骤有改两个地方，
我用2% Gel，所以binding buffer多一倍
很久之前有发现DNA会不纯，所以wash buffer再多洗一次
4. Elution step 用过ddH2O和 Elution buffer，状况都一样，
担心是污染造成DNA degradation，所以 ddH2O和Elution buffer都有换过。
另外担心可能DNA残留在column上，有多通一次Elution step，
结果第二管去跑胶和 nanodrop 检测都没有DNA。
5. DNA 有可能自己乱组合，有95度C 煮10分钟後自然冷却，但是没有改善。
6. 考虑到个人实验操作的影响，有请另一人帮忙单独做一次，结果还是一样惨。
而且positive control 没问题。
7. 这实验在上礼拜做其他病人检体没问题，有拿上礼拜不同病人的旧检体再做一次，
旧检体没问题。
还有可能是哪边出问题?
PCR结果虽然不是单一产物，但是毕竟主要的产物还在，
控制组也没问题，所以PCR有问题的嫌疑很小。
总觉得还是纯化kit嫌疑最大，但是控制组和旧检体又可以做成功。
最後要回归到这次检体本身身上?
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1F：推 joseph103331: 有没可能DNA根本没到column上面? 01/18 22:32
感谢提醒,我跑看看过column後的DNA是否还在
2F：→ blence: 如果260/280在范围内,测得浓度对比control符合PCR产物亮度 01/18 23:04
3F：→ blence: 我会试着往下做;感觉只是有"东西"影响gelling,产物还是在 01/18 23:04
感谢,我会回头测看看,往下做是要定序,尝试後发现定序很差或失败
※ 编辑: patricksky (49.159.106.6), 01/18/2018 23:50:35
4F：→ ernielwl: 有没有切胶的gel前後对照的图?我觉得PCR产物可能有问题 01/19 02:09
5F：→ ernielwl: 毕竟变因就差在检体不同 01/19 02:11
切胶没问题
後来回头测DNA後，发现这批纯化的PCR DNA quality都特别差...
应该是某些东西抓在DNA上...可能要多洗几次column了
※ 编辑: patricksky (220.136.109.82), 01/19/2018 16:00:15
6F：→ milkpa: 有没有第一次跑胶的照片 01/19 17:51
7F：→ blence: 怕改了操作後定序是不是失败,可以先拿产物再上一次PCR试试 01/20 04:20