作者sunnyandsund (sunny)
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标题[求救] western blot压出空白片
时间Sat Jan 20 23:53:33 2018
我最近在做western blot
我大学到研究所期间都做过western blot
都有做出结果
现在到其他实验室做WB却做不出来
实验室的人几乎都做过WB
只是不是在这间实验室做的
是在其他实验室做的
所以东西药品是旧的
细胞蛋白抽取後测完浓度冰到-80
然後加6X sample buffer煮5分钟
loading到10% SDS PAGE上胶80V 下胶120V
marker有分开
transfer buffer 是用tris和glycine也有加20% methanol和0.4% SDS
transfer用biorad 的tank 条件是300mA 1.5hr
转到NC membrane上
marker每条都有转过去
然後因为之前第一次做的时候也是都空白片
所以这次有用ponceus S染膜
却没染出任何东西
我们没有染胶 因为没有comasin blue
然後就5% milk blocking
一抗目标抗体1:1000 overnight 二抗anti-mouse 1:5000
暗房压片 ECL作用3分钟 压片5分钟 底片超乾净 没东西
strip後 blocking 1hr
1Ab anti-bactin 1:5000 overnight 4度C
2ab anti-mouse 1:5000 1hr RT
TBST wash 三次 十分钟後
暗房压片 ECL作用3分钟 压片10分钟
底片很乾净没东西
想问这是什麽问题?
还有因为我以前都是用PVDF膜
但这里是用NC的
我的transfer条件是用以前的方式
想问NC的transfer 条件是?
就是关於时间和安培的部分
谢谢
我真的做到快崩溃
希望大家解救阿
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1F：→ milulittle: 奶粉是好的吗 01/21 01:35
2F：→ e104582001: NC用法很不一样... 01/21 01:50
3F：→ aj1139: 我跟你的方法几乎完全一样 01/21 08:24
4F：→ aj1139: 换成PVDF就好了 01/21 08:24
6F：→ aj1139: Q18Nv 01/21 08:33
8F：推 aj1139: 我目前的lab也是NC membrane做不出来，虽然我自己觉得这 01/21 08:35
9F：→ aj1139: 东西没有过期的问题，但由於我同样的做法换成PVDF就做出 01/21 08:35
10F：→ aj1139: 来了，实在让我不得不怀疑NC 01/21 08:35
11F：→ turtle24: ponceus S没染到东西，会不会是定量或稀释的问题 01/21 08:58
12F：→ ender: 我是这篇的原PO,因为我的帐号暂时不能回,我先借别人的回 01/21 13:35
13F：→ ender: M大 我的牛奶是新买的,应该是没问题.E大想请问NC用法不同, 01/21 13:36
14F：→ ender: 是指哪方面不同?那他transfer的条件是? 01/21 13:37
15F：→ ender: A大 我们目前可能不太能换成PVDF阿 01/21 13:38
16F：→ ender: 想请问为何ponceus S没染到会是蛋白稀释和测浓度的问题? 01/21 13:39
17F：推 joseph103331: NC有点脆弱不太能strip,ponceus S没染到东西很怪 01/21 16:46
18F：推 ABULA666: 好奇如果你现在待的实验室是用NC片，有参考先前的操作方 01/21 22:41
19F：→ ABULA666: 法吗？如果没有，你写的步骤从何处参考？不过除了这些， 01/21 22:42
20F：→ ABULA666: 用Ponceus S染胶没染出东西问题更大，应该是前处理样本 01/21 22:43
21F：→ ABULA666: 就有问题。 01/21 22:43
22F：→ aj1139: 如果你人在台北，我借你PVDF跟comassie blue做troublesho 01/22 07:46
23F：→ aj1139: oting如何？有需要请私 01/22 07:46
24F：推 pent: gel 上有东西嘛？ 01/22 16:14
25F：→ blence: NC有看到marker,ponceus S没染到band,先去关心有无蛋白 01/22 17:16
26F：推 TAKONA: 我实验室用GE NC膜, transfer 300mA 2 hr 01/23 03:18
27F：推 exosome: Transfer 时取消 0.4% SDS 试试 03/03 13:37