作者migu0531 (migu0531)
看板Biotech
标题[求救] 蛋白定量
时间Fri Jan 26 23:46:53 2018
小妹待的实验室最近卡在western blot定量的问题，事情是这样的……
https://i.imgur.com/YAMFUkz.jpg
依照别人留下来的方式，同时用含有目标蛋白的全细胞lysate（冷冻解冻三次的方式破细
胞）和已知浓度的纯化蛋白，分
别3倍连续稀释去做western，再看呈色的条带粗度比较相应的目标蛋白含量。
用自制的10%胶，蛋白上样10ul，running buffer是tris-glycine，跑上胶50v 30分钟，
下胶120v 50分钟。transfer使用i-blot快速转渍9分钟，用市售的t- pro blocking buff
er室温下摇晃作用1小时，使用的是动物免疫实验采集的血清作为一抗作用1小时（血清先
用IFA测定力价，western使用则是把测定的力价稀释到4x IFA。例如力价IFA 2048x >> I
FA 4x，western 用4ml blocking，则加7.8 ul）。二抗AP cong.是市售abcam 抗体稀释1
000倍，室温1小时。所有wash步骤都是每次3分钟，共洗5次。呈色用thermo Bcip/NBT 呈
色时间都不太固定，会视背景和显色程度，大概都是在3~5分钟。
但不管我怎麽去调整blocking时间、一抗和
二抗的稀释倍数，最後呈色都很脏，甚至有一圈一坨的影子。直接用手机拍照。（如图）
小妹认为直接从动物身上分离的血清会很脏，会有很多干扰。请问还有什麽方式可降低血
清背景干扰?
另外，小妹认为western适合定性，不适合定量，所以有想到用elisa的方式。
想法是这样……用已知的浓度的纯化蛋白和目标蛋白lysate做连续稀释进行抗原coat
ing，一抗的动物血清使用固定的稀释倍数，最後用reader读值。将已知浓度的读值拉标
准曲线，把未知的读值去套用，计算出相对的蛋白量。不知道这方式是否可行?
顺便问问，不走纯化路线的话，还有哪些方式可以进行蛋白定量??
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※ 编辑: migu0531 (101.14.230.143), 01/26/2018 23:50:31
1F：推 joseph103331: ELISA比较适合定量 WB抗体不好还是算了01/27 00:25
2F：推 rasaze: 一圈一圈的这看起来比较像transfer或western 过程不乾净， 01/27 01:32
3F：→ rasaze: lysate干扰会比较像是很多杂band，不过诚如1楼所说用elisa01/27 01:32
4F：→ rasaze: 定量会好一些01/27 01:32
5F：→ Ianthegood: 你有用保鲜膜？有压平？01/27 03:21
6F：→ migu0531: 那elisa定量可以用我想的这方式进行吗？有没有需要调整01/27 10:59
7F：→ migu0531: 的?01/27 10:59
8F：→ migu0531: Western wash的时间我也有拉长，但如果是transfer的问题 01/27 11:01
9F：→ migu0531: 话，会是什麽? 我都用i-blot快速转渍。但如果做其他纯01/27 11:01
10F：→ migu0531: 化的蛋白就不会有这样一圈一圈的现象01/27 11:01
11F：推 duriamon: 其实你这个方法已经足够了，问题是你的转印後的某个步骤 01/27 14:24
12F：→ duriamon: 有很大瑕疵，你如果是底片呈色最好在暗房确定是不是蛋白 01/27 14:24
13F：→ duriamon: 质太多或呈色剂太强，有时候太强你会看到呈色剂被催化太 01/27 14:24
14F：→ duriamon: 快，在塑胶片跟底片之间一边扩散一边发光。ELISA其实不 01/27 14:24
15F：→ duriamon: 会比较好，只是眼不见为净，你要用ELISA最好要用sandwic01/27 14:24
16F：→ duriamon: h的方式，也就是需要两个抗体分别抓你要检测之蛋白质的01/27 14:24
17F：→ duriamon: 不同端，要不然误差比你现在的方式还大。01/27 14:24
18F：推 duriamon: 上面不小心打错，是塑胶片跟膜之间。你可以把膜放到装有01/27 14:33
19F：→ duriamon: 呈色剂的盒子内摇一摇，然後用镍子夹起来让膜上的液体稍01/27 14:33
20F：→ duriamon: 微滴乾再压片试试。通常在暗房压片不要急着用底片呈色，01/27 14:33
21F：→ duriamon: 应该要先观察冷光强度，如果肉眼都能很明显看到，那通常 01/27 14:33
22F：→ duriamon: 代表冷光太强了，要再重新调整。01/27 14:33
23F：推 duriamon: 至於你说的“直接从动物身上分离的血清会很杂，会有很多01/27 14:39
24F：→ duriamon: 背景干扰。”其实是不存在的。因为你做的是western-blot 01/27 14:39
25F：→ duriamon: ，由於转印前面是电泳的关系，你所谓的背景怎麽可能会一01/27 14:39
26F：→ duriamon: 圈一圈的出现在膜上呢？01/27 14:39
27F：→ Ianthegood: 加完ecl後 滴乾 背面跟角落用擦手纸吸乾 再准备压 保01/27 17:59
28F：→ Ianthegood: 险膜/塑胶片用滚轮滚过确保没有空隙01/27 17:59
29F：→ Ianthegood: 你的图有扫过处理过吧 看不太出来原本的intensity 那01/27 18:03
30F：→ Ianthegood: 个pattern也有可能是membrane/底片老化或潮到 可以压 01/27 18:03
31F：→ Ianthegood: 张白片做control01/27 18:03
32F：→ migu0531: 我不是用压片的方式~01/27 23:24
33F：→ migu0531: 背景有两的问题，一个是出现一圈或是一坨的，另一个是 01/27 23:26
34F：→ migu0531: 整张membrane背景容易黑掉 01/27 23:26
36F：→ migu0531: 会像这图一样，连我的marker，和目标条带都快跟北京融 01/27 23:30
37F：→ migu0531: 为一体了！01/27 23:30
38F：→ migu0531: 背景01/27 23:30
39F：推 duriamon: 说实在…你自己不讲清楚没人知道你再干嘛，我想应该没人01/27 23:40
40F：→ duriamon: 喜欢玩这种猜谜游戏吧…。01/27 23:40
41F：推 duriamon: 另外你目前这种古早呈色方式…我看问题是蛮大的…跟要不01/27 23:46
42F：→ duriamon: 要换ELISA恐怕是没什麽关联。01/27 23:46
43F：推 joseph103331: 想问为什麽动物分离的血清背景会很脏这件事情是不 01/28 01:00
44F：→ joseph103331: 存在的，因为是做WB? 我这边就有好多是很脏的血清.01/28 01:00
45F：→ joseph103331: ...01/28 01:00
46F：推 duriamon: 建议楼上可以再把我之前打的回覆多看几次，然後想一想我 01/28 05:20
47F：→ duriamon: 在讲甚麽。01/28 05:20
48F：推 joseph103331: 如果是说血清杂的话,背景应该要有一条一条的杂讯01/28 22:25
49F：→ joseph103331: 我也遇过血清会辨认membrane,结果整片黑,跟电泳无关01/28 22:25
50F：→ joseph103331: 直接拿membrane去做背景就脏了01/28 22:26
51F：推 joseph103331: 这种情况要调整blocking reagent,但也不保证成功01/28 22:33
52F：→ joseph103331: Western可变因子太多,在有纯化蛋白质的条件下,我觉 01/28 22:34
53F：→ joseph103331: 得改成ELISA可能会较好,但要注意cell lysate的影响01/28 22:34
54F：推 duriamon: 其实我并不怀疑血清会影响蛋白质条带的背景讯号，但老实01/29 10:34
55F：→ duriamon: 说要如何解释并说服人“血清会辨认转印膜这种事”？身为 01/29 10:34
56F：→ duriamon: 科学家如果不能用逻辑思维做实验并推论，那跟去庙里求神 01/29 10:34
57F：→ duriamon: 问佛有什麽差别？样品为何要跑电泳不就是为了将蛋白质有 01/29 10:34
58F：→ duriamon: 方向有规则的分离开，一旦完成电泳蛋白质在胶体的位置就 01/29 10:34
59F：→ duriamon: 暂时固定，除非你放太久产生扩散要不然转印後的位置就应01/29 10:34
60F：→ duriamon: 该与电泳的位置相同。蛋白质转印後有没有机会从转印膜跑01/29 10:34
61F：→ duriamon: 下来结合到非条带的区域？是有机会的，一种是你转印过久01/29 10:34
62F：→ duriamon: 蛋白质穿过转印膜经扩散或是湿式转印搅拌时黏上去。另一01/29 10:34
63F：→ duriamon: 种是你样品中的蛋白质过量，超过转印膜的capacity，多的01/29 10:34
64F：→ duriamon: 蛋白质就虽转印液到处黏。总之这都是不正常的状况，蛋白01/29 10:34
65F：→ duriamon: 质下多少、转印跑多久、转印膜的材质、转印液有无重复使 01/29 10:34
66F：→ duriamon: 用都是可评估的。01/29 10:34
67F：推 joseph103331: 你仔细想想为什麽要做blocking,就知道血清为什麽结01/30 19:41
68F：→ joseph103331: 合membrane了,这类讯号用glycine是可以冲提的 01/30 19:42
69F：→ joseph103331: 其实原PO要做的事情很简单,一没有要观察片段大小,二01/30 19:45
70F：→ joseph103331: 来拥有标准品,是两种WB跟ELISA都合适的条件01/30 19:45
71F：→ joseph103331: 选择可变因子小的方法做调整,会比较理想01/30 19:46
72F：→ migu0531: J大说的用glycine冲提是什麽意思?01/30 20:58
73F：推 joseph103331: 用pH3.0的glycine可以冲下membrane上的蛋白质结合01/30 22:18
74F：→ joseph103331: 有些人使用coating在膜上的蛋白质来纯化抗体会用 01/30 22:18
75F：推 duriamon: 你转印的时候会用pH 3的glycine?我是不知道你的实验目的01/31 10:40
76F：→ duriamon: 是什麽。但你不觉得这跟正常的western-blot步骤还有这个01/31 10:40
77F：→ duriamon: 主题没有关联吗？另外一提正常用来blocking的溶液pH也不 01/31 10:40
78F：→ duriamon: 会是酸性的，你如果说要做stripping我还会信。其实本讨 01/31 10:40
79F：→ duriamon: 论的问题点我早就回覆了，去争论这些没什麽意义，至於你 01/31 10:40
80F：→ duriamon: 要相信什麽我也无法影响你。 01/31 10:40
81F：→ migu0531: 希望这讨论别引起战争。 我相信血清对上没有纯化的蛋白01/31 12:27
82F：→ migu0531: ，背景会脏这件事，以前老师是这样跟我们说。但现在实01/31 12:27
83F：→ migu0531: 验室认为是我操作的问题，所以上来寻求其他方式01/31 12:27
84F：推 ararthur: 血清容易不乾净+1 通常是大量的IgG.albumin的干扰 可以01/31 12:41
85F：→ ararthur: 找到相应的去除方式 甚至kit 另外你不是用压片的方式是01/31 12:42
86F：→ ararthur: 指... 你用照相仪器侦测? 还是直接染membrane? 我其实看01/31 12:43
87F：→ ararthur: 不太出来 可以请你说详细一些吗 01/31 12:43
88F：→ ararthur: 这一圈一圈的脏污 却没有影响到band 我判断不是running01/31 12:44
89F：→ ararthur: 或transfer的问题 可能是membrane本身品质 或染抗体不匀01/31 12:45
90F：→ ararthur: 所导致 01/31 12:45
91F：→ blence: 原po应该不知道问题在原本内容交代不清,推文只能用猜谜01/31 13:02
92F：→ blence: 要从WB改变成ELISA,我认为至少先确认问题是WB技术瓶颈,而01/31 13:02
93F：→ blence: 不是人为因素改变策略才有必要,毕竟ELISA怎说一定顺遂呢?01/31 13:03
94F：→ blence: 推文说不是压片,但两张连结不像是照相,我有误会吗？01/31 13:06
95F：→ Ianthegood: 那个一看就不是抗体的问题01/31 18:32
96F：推 Ianthegood: 再者如果你觉得是抗体不好 你完全无法确认elisa的讯 01/31 18:35
97F：→ Ianthegood: 号是你的protein01/31 18:35
※ 编辑: migu0531 (101.12.146.105), 01/31/2018 19:20:29
※ 编辑: migu0531 (101.12.146.105), 01/31/2018 19:20:53
98F：→ migu0531: 是用手机照相的 01/31 19:22
99F：→ migu0531: 另外，只有在做这全蛋白的western才会有这样的现象。其 01/31 19:59
100F：→ migu0531: 他纯化的蛋白用市售的抗体则不会这样 01/31 19:59
101F：→ blence: 你看推文应该会觉得不少人误解呈色方法,那时就该介入澄清 01/31 20:06
102F：推 duriamon: 她自己可能也不了解自己的实验在做什麽，或跟其他实验室 01/31 20:45
103F：→ duriamon: 有什麽不同，但我猜这照片应该不是最常被使用的冷光底片 01/31 20:45
104F：→ duriamon: 呈色，而是用NBT 之类的试剂直接在膜上呈色，所以照片里 01/31 20:45
105F：→ duriamon: 的图才不像是底片透明的，那些一坨一坨的背景是色素沉淀 01/31 20:45
106F：→ duriamon: 在膜上。 01/31 20:45
107F：推 duriamon: 我回覆完才看到原po修改的内容了，刚楼上打的就当作是多 01/31 20:55
108F：→ duriamon: 余的吧。 01/31 20:55
109F：推 duriamon: 你打清楚後答案就很明显了。问题很有可能来自你使用的一 01/31 21:05
110F：→ duriamon: 抗是自制的动物血清，还有你用的blocking试剂。简单来说 01/31 21:05
111F：→ duriamon: 一抗最好越纯越好(用自制的以後发表时麻烦会多许多)，而 01/31 21:05
112F：→ duriamon: blocking试剂不是用commercial就一定没问题。当然NBT这 01/31 21:05
113F：→ duriamon: 个方法背景值比冷光呈色高也可能使你的问题更严重。 01/31 21:05
114F：推 joseph103331: 只能说抗体不好, 做什麽都不会顺遂.... 01/31 22:37
115F：→ joseph103331: 若是时间财力允许, 进一步纯化抗体会比较好 01/31 22:37
116F：→ tz2733: 建议换呈色方法 02/01 00:19
117F：→ tz2733: 改用冷光呈色(CDP-STAR之类) 然後再来修正blocking 抗 02/01 00:36
118F：→ tz2733: 体等条件 我会先选择1抗改成4度C 摇o/n 再来修正blocking 02/01 00:36
119F：→ tz2733: buffer(浓度 种类) 都不行我就会说1抗不优不好用T.T 02/01 00:36