作者zzxc87520 (珼珼)
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标题[求救] H1299肺癌细胞养不起来
时间Thu May 3 23:44:15 2018
大家好
目前解冻後的H1299肺癌细胞
一直养的不是很理想
这边列出步骤跟细胞的状况
想知道问题到底出在哪里
使用的medium 是 DMEM+sodium pyruvate
步骤
1.细胞从液态氮取出後立即解冻直接放进medium 中
medium 我大概是用10-15cc在dish
2.确认一下有均匀分布後就直接放进培养箱
3.隔天会换medium 大约7-8cc （会用PBS清洗）
细胞状况
1.贴壁的情况不是很好，有很多细胞会飘起来。
2.本以为是可能原本细胞冻太稀，所以後来是用
6公分的dish把细胞液分两盘养，medium 是4-5cc,再加0.5cc细胞液，但情况差不多，有贴但也很飘，可是medium 没有变色也没有混浊。
6公分的dish把细胞液分两盘养，medium 是4-5cc,再加0.5cc细胞液，但情况差不多，有贴但也很飘，可是medium 没有变色也没有混浊。
3.解冻的隔天我会看一下细胞的状况，但常常看到有一点一点的黑色碎屑在细胞旁边，不太确定是什麽东西，仔细看会感觉有在跳动，晃动dish的时候碎屑不太会移动。
4.H1299听学姊描述是会展开有点像神经细胞的样子，会有角的，我解的细胞有展开但很多都是圆圆的，但不是全部都会飘。
之前解冻第一管没长好
我後来看medium中有白色的漂浮物
所以有换过medium
解第二管的时候情况也没有好转
所以我觉得不是medium的问题
（我有test新的medium 但没有长东西）
可是每次隔天看细胞都还是有黑色碎屑
我不确定是污染还是寄生虫
或是只是代谢物
手法的部分，我觉得我满轻巧的
都是吸出後直接加进medium 里
而且还是轻轻的注入
如果是冻管本身的问题我该如何处理好呢
我已经解了大概4管都长不起来
我已经解了大概4管都长不起来
我也不太动他怕他长不好
大概两天看一次
学姊说他之前有养成功
让我更挫折
我找不到原因在哪里害我很慌张
我有养另一株肺癌细胞A549
这株学姊说比较好养叫我先做这株
养的也蛮顺利的已经culture 很多代了
但对H1299始终没有办法
请大家救救我感谢大家
--
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1F：→ roy047: DMSO 有洗掉吗？05/04 00:11
2F：推 tynse71864: 听起来是冻坏或污染？ 後者不太有救…05/04 00:12
3F：→ tynse71864: 血清是哪个等级的?05/04 00:13
4F：推 joseph103331: 或许是冻坏，碎屑可能是死细胞碎片，会影响细胞生05/04 02:09
5F：推 joseph103331: 或许是冻坏，碎屑可能是死细胞碎片，会影响细胞生05/04 02:09
6F：→ joseph103331: 长，如果有部分贴附可以考虑置换medium，等到细胞05/04 02:09
7F：→ joseph103331: 群长起来再打散继代05/04 02:09
8F：→ Medical: Medium回溶以後会离心去DMSO 再丢进去dish 隔天再换一次05/04 10:49
9F：→ Medical: medium 确保DMSO移除05/04 10:49
10F：推 o81628: 我之前解冻DMSO没有移除，H1299照样长，也许不是这个问题05/04 16:44
11F：推 steve42125: 听起来比较想冻坏耶 冻在哪冻多久?05/04 16:45
12F：→ steve42125: *像 个人也是养A549跟H1299 这两株应该都算是生命05/04 16:46
13F：→ steve42125: 力强又好养也不太漂的05/04 16:46
14F：→ Sylvaine: 你们H1299是用DMEM养？我以前是用RPMI1640养，不晓得有05/05 00:41
15F：→ Sylvaine: 没有差？05/05 00:41
16F：→ Sylvaine: 不过如果实验室长期以来用DMEM养都OK，有没有可能是冻05/05 00:43
17F：→ Sylvaine: 坏了呢？05/05 00:43
18F：推 qaz01817: 我能借题 问一下 什麽是冻坏了?05/05 15:32
19F：→ qaz01817: 是指冻细胞的流程出问题?还是细胞保存的过程有问题?05/05 15:32
20F：推 tynse71864: 楼上说的都有可能； 冻的时候降温过快，回温解冻不够05/05 16:25
21F：→ tynse71864: 快，加入的 DMSO不足量等等05/05 16:25
05/05 16:25
先感谢各位的回覆，我没有洗掉DMSO，我是直接加入medium隔天再用DPBS洗，然後换新的medium。
细胞是冻在液态氮里是2017/07/26冻的，同一桶里的细胞学姊也常在解冻其他细胞，应该不是液态氮桶的问题...吗？
冻管是大学姊冻的，我上一届的学姊有说他觉得H1299比A549难养，可是大学姊跟我上一届学姊说他们养的起来呜呜呜，我觉得好挫折。
这边想问一下各位大大，如果先离心去除DMSO的话会比较好吗？这个步骤会算是回温不够快吗，我一直不敢尝试，因为大家都建议要1分钟内回温。
※ 编辑: zzxc87520 (110.50.175.86), 05/06/2018 00:56:04
22F：推 tynse71864: 放37度水浴槽到冻管快溶即可;後离1000rpm 3min，吸去 05/06 10:59
23F：→ tynse71864: 上清回溶到 medium里。 05/06 10:59
24F：→ tynse71864: 有时候没离掉细胞飘很惨@@ 05/06 11:00
25F：→ blence: classroom.bcrc.firdi.org.tw/home/cell/cell_thrawing 05/06 15:54
26F：→ blence: 除非体积太少,冷冻细胞在1分钟内就回溶比BCRC预估时间还快 05/06 15:54
27F：推 joseph103331: 自己做的时候1mL实际回溶时间大概在1~2min左右 05/06 15:56
28F：→ blence: 多数癌细胞也不需回溶时除去DMSO,隔天换medium还比较好 05/06 15:56
29F：→ bj59420: 之前养1299跟A549都觉得很好养，不过我也是用PRMI 05/07 07:48
30F：推 david31408: 冻坏了 看有没有更早之前的passage 05/07 10:22
31F：→ david31408: 我之前有养过MDCK 发生过一样的事情 但我的细胞会长 05/07 10:23
32F：→ david31408: 长得比之前的慢 黑色碎片会变多 05/07 10:23
33F：→ david31408: 换早期一点的代数重新解冻养就行了 05/07 10:23
34F：→ steve42125: 抱歉 同为H1299有问题想借串发问请教培养经验 05/10 00:30
35F：→ steve42125: 我在Trypsinize时会放incubator 每2 3分钟会轻拍然後 05/10 00:31
36F：→ steve42125: 观察 但是发现常常细胞虽然已经全部都有飘起来 但都 05/10 00:32
37F：→ steve42125: 会有小小聚成团的方式 离心打散pellet种下去还是会有 05/10 00:32
38F：→ steve42125: 想请问有人有没有解决的经验或建议的解决方式 感谢! 05/10 00:33
39F：推 SherryKu: 有没有可能是打得不够散？先以1-2mL打散均匀之後再种看 05/12 11:52
40F：→ SherryKu: 看呢 05/12 11:52
41F：→ steve42125: 我都是用1ml的medium打散 但感觉还是会稍微有点小团 05/12 12:13
42F：→ steve42125: 才想说有没有其他的选项可以尝试XD 05/12 12:13
43F：推 joseph103331: 在pellet的时候可以先敲散 然後再加medium打散 05/12 13:52
44F：→ steve42125: 这招我倒是没想到 谢谢建议!XD 05/12 16:26
45F：推 ChesterYeah: medium 先回温到37度，加到盘子里。 05/25 07:50
46F：→ ChesterYeah: 细胞冻管迅速回温，然後滴入medium 05/25 07:52
47F：推 ChesterYeah: 过8小时去摇摇盘子看贴了没，贴了之後立刻换medium， 05/25 07:54